丹波黑大豆醛脱氢酶基因GmALDH31的克隆原核表达和功能分析.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（５）：８６９２ 丹波黑大豆醛脱氢酶基因ＧｍＡＬＤＨ３１的克隆、 原核表达和功能分析 张　乐　陈宣钦　王　琳　陈丽梅　李昆志 （昆明理工大学生命科学与技术学院　昆明　６５０５００） 摘要　醛是一类具有高度反应活性的毒性物质，在生物体中主要由膜脂过氧化，氨基酸氧化和蛋 白质的糖基化产生。醛脱氢酶（ａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡＬＤＨ）是一类以多种醛类为底物的酶类， 醛脱氢酶基因是一类编码将醛脱氢氧化为相应羧基酸的基因，在植物，动物和微生物中均有发 现。通过ＲＴＰＣＲ方法从丹波黑大豆根中扩增出基因ＧｍＡＬＤＨ３１。构建原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ １ＡＬＤＨ３１，在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１中表达，并研究不同浓度ＩＰＴＧ、时间和温度对ＡＬＤＨ３１蛋白表达的影 响，结果表明２８℃下诱导６ｈＡＬＤＨ蛋白表达量最大，而ＩＰＴＧ浓度对ＡＬＤＨ３１的表达量影响不 大。在添加有不同浓度Ａｌ、Ｃｕ和Ｃｄ的液体ＬＢ培养基中培养转化菌和对照菌，检测转化菌和对 照菌的生长曲线，生长曲线实验结果表明ＡＬＤＨ３１转化工程菌对上述金属离子具有一定的耐受 性。这些结果为进一步研究其结构和生物学功能奠定了基础。 关键词　大豆　ＡＬＤＨ　序列分析　原核表达　金属抗性 中图分类号　Ｑ７８ ［８］ 　　醛类物质是一类具有高度反应活性的毒性物质， ＡＬＤＨ５，ＡＬＤＨ６和ＡＬＤＨ１０家族 。ＡＬＤＨ在生物体中 是多个代谢途径的中间产物，包括维生素、氨基酸、碳 具有四种主要功能：脱毒，参与代谢，渗透保护和 ＮＡ 水化合物、甾体和膜脂等代谢途径。醛主要来源于膜 （Ｄ）ＰＨ的再生。由于ＡＬＤＨ具有脱毒保护功能，许多 脂过氧化，蛋白质糖基化和氨基酸氧化。过量的醛与 研究者致力于 ＡＬＤＨ与逆境胁迫关系的研究。Ｗｕ 蛋白和核酸反应形成加合物，破坏蛋白和核酸的正常 ［９］ 等 在水稻中发现了２０个醛脱氢酶基因，这些基因分 ［１４］ 结构和功能 。醛脱氢酶（ａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， 别隶属于１０个亚家族，值得注意的是２０个基因中有 ［１０］ ＡＬＤＨ）是一类以多种醛类为底物的酶，ＡＬＤＨ在催化 １２个与干旱或高盐胁迫有关。Ｋｉｒｃｈ等 在拟南芥中 ＋ 也发现了ｌ４个醛脱氢酶基因，分别隶属于９个亚家族， 醛氧化为羧酸时，将 ＮＡＤ（Ｐ）还原为ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ。目 前在植物中发现的 ＡＬＤＨ包括 １４个家族：ＡＬＤＨ２， 其中３个基因被发现与非生物逆境相关。ＡＢＡ和干旱 ＡＬＤＨ３，ＡＬＤＨ５，ＡＬＤＨ６，ＡＬＤＨ７，ＡＬＤＨ１０，ＡＬＤＨ１１， 胁迫诱导玄参目抗旱植物ＣｒａｔｅｒｓｔｉｇｍａｐｌａｎｔａｇｉｎｅｕｍＣｐ ＡＬＤＨ１２，ＡＬＤＨ１８，ＡＬＤＨ１９，ＡＬＤＨ２１，ＡＬＤＨ２２，ＡＬＤＨ２３ ＡＬＤＨ的上调表达。重金属和氧化胁迫诱导拟南芥 ［５７］ ＡｔｈＡＬＤＨ３的表达，在拟南芥中过量表达 ＡｔｈＡＬＤＨ３ 和ＡＬＤＨ２４ 。根据ＡＬＤＨ基因家族编码蛋白催化的 ［７］ 提高了其对抗重金属和氧化胁迫的能。水稻淹水胁迫 底物特异性不同，可分为非特异性和特异性ＡＬＤＨ 。 非特异性ＡＬＤＨ的底物包括各种芳香醛和脂肪醛，特 后，ＡｌＤＨ２ａ的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平都增加，体外实 异性 ＡＬＤＨ主要以半缩醛和甜菜碱醛为底物，如 验证明ＡＬＤＨ２ａ具有很高的乙醛氧