肠球菌心内膜炎抗原efaA在粪肠球菌生物膜形成中的作用-病原生物学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 3 肠球菌心内膜炎抗原 efaA 在粪肠球菌生物膜形成中的作用 中文摘要 目的：探讨肠球菌心内膜炎抗原 efaA 与肠球菌生物膜形成之间的相关性，为深入 研究肠球菌生物膜的致病性及耐药性奠定基础。 方法： 1. 利用普通光学显微镜观察 efaA+、efaA- 粪肠球菌在玻片上的生物膜形成过程， 初步判定肠球菌生物膜形成各阶段的时间点； 2. 微量滴定板法比较 efaA+、efaA- 粪肠球菌的生物膜形成能力：细菌接种至 96 孔 板中，培养不同时间后弃去培养液，结晶紫染色，乙醇-丙酮混合液溶解，酶标仪测定 比较不同阶段 efaA+ 、efaA- 菌的 OD570 值； 3. MTT 法比较 efaA+、efaA- 粪肠球菌生物膜的活菌含量： 细菌接种至 96 孔板中， 培养不同时间后弃去培养液，MTT 孵育后 DMSO 溶解，酶标仪测定比较不同阶段 efaA+ 、 efaA- 菌的 OD492 值； 4. 共聚焦激光扫描显微镜观察比较 efaA+、efaA- 粪肠球菌所形成的生物膜：各菌 株在玻片上形成生物膜，AO/EB 染色后 CLSM 观察，比较 efaA+、efaA-菌所形成生物膜 的厚度及生物膜内层、中层、外层的细菌密度和活菌比例，并做统计学分析。 5. 采用 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR，检测 efaA+、efaA- 粪肠球菌在细菌培养 皿内培养不同时间后所形成生物膜的 efaA mRNA 的表达，与生物膜的厚度变化进行对 比。 结果： 1. 肠球菌生物膜黏附期为 2h，基本形成期为 6h，成熟期为 24h，播散期为 48h。 2. 微量滴定板法比较生物膜形成能力，efaA+ 粪肠球菌在各培养时间点的 OD570 均 大于 efaA- 菌，即 efaA+ 粪肠球菌的生物膜形成能力比 efaA- 菌的强； 3. MTT 法比较生物膜不同阶段的活菌含量（OD492），efaA+ 粪肠球菌在各培养时间 -点的 OD492 均大于 efaA - 菌，即 efaA+ 粪肠球菌所形成的生物膜的活菌数比 efaA- 菌的多； 4. 共聚焦激光显微镜观察，efaA+ 粪肠球菌在不同阶段所形成的生物膜的厚度、细 菌密度及活菌比例均比 efaA- 菌的大； 5. efaA+ 粪肠球菌 efaA mRNA 的表达量随培养时间的延长而增加，24h 时达最高水 平，随后表达量降低，与生物膜平均厚度变化趋势相平行；efaA- 粪肠球菌未检测到 efaA mRNA 表达。 结论：肠球菌心内膜炎抗原 efaA 基因有利于肠球菌的粘附和生物膜形成。 关键词：粪肠球菌 生物膜 efaA CLSM 实时荧光定量 PCR Effect of Enterococcus endocarditis antigen efaA on the forming process of enterococcus faecalis biofilms Abstract Objective: In this work we investigate the relationship between enterococcus endocarditis antigen(efaA) and biofilm formation, in order to do the groundwork for further study of E.faecalis biofilm’s pathogenicity and antibiotics resistance. Methods: Using ordinary optical microscope to observe the biofilm formation of efaA+, efaA- E.faecalis on cover glasses at different incubation time,we generally identify biofilm formation time. 1% crystal violet(CV) stain the adhesion of different stages’ enterococci on the 96-well plate.CV was solubilized in ethanol-acetone, and optical density at 570 nm, in order to compare the biofilm formation ability of efaA+, efaA- E.faecalis. MTT method was used to test viable bacteria counts of efaA+, efa