茶多酚对草甘膦致小鼠睾丸支持细胞损伤的保护作用-护理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 茶多酚对草甘膦致小鼠睾丸支持细胞损伤的保护作用 摘 要 目的： 研究茶多酚（tea polyphenols，TP）对草甘膦（glyphosate）诱导小鼠睾丸支持 细胞（sertoli cell，SC）氧化损伤的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制。 方法： 分离、纯化、体外培养 18~20 日龄小鼠睾丸支持细胞，采用 FasL 免疫细胞化 学方法鉴定支持细胞纯度，将培养 5~7d 的支持细胞随机分组：①正常对照组；② 草甘膦损伤组：以草甘膦 60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml 五 个浓度对支持细胞损伤 24h，根据不同剂量对支持细胞的抑制率，计算出草甘膦的 半数抑制浓度（IC50），以草甘膦 IC50 染毒 24h 建立支持细胞损伤模型；③茶多酚 保护组：以茶多酚 5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml 六个 浓度分别预处理细胞 12h 后再给予草甘膦半数抑制浓度损伤 24h，观察不同浓度茶 多酚对草甘膦诱导支持细胞损伤的影响。 噻唑蓝（MTT）法检测支持细胞存活率，观察茶多酚对草甘膦损伤支持细胞存 活率的影响；用倒置显微镜观察支持细胞形态学改变；比色法检测乳酸脱氢酶(LDH) 释放量；测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的 活力及丙二醛(MDA)的含量；采用 Hoechst33342 荧光染色法观察不同处理因素对 细胞核形态的改变；TUNEL 法原位检测细胞凋亡情况；采用半定量 RT-PCR 观察 支持细胞 ABP mRNA、Vimentin mRNA 的表达。 结果： 1.经Fas-L免疫细胞化学染色法鉴定，分离纯化后所得到的小鼠睾丸支持细胞纯度 达到 90%以上。 2.加入不同浓度的草甘膦(60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml )， 损伤支持细胞 24h 后，草甘膦对支持细胞活性的损伤呈剂量依赖性。根据不同剂 量抑制率计算出草甘膦的半数抑制浓度为 90μg/ml。 3. 不同的茶多酚预处理时间和预处理浓度对支持细胞产生不同的影响，可明显拮 抗草甘膦 90μg/ml 对支持细胞存活率的抑制作用，茶多酚 40μg/ml、80μg/ml 预处 理 12h，细胞存活率提高至 78.6%和 86.2%；茶多酚 20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml 预处理 24h 与茶多酚 10μg/ml、20μg/ml 、40μg/ml 预处理 48h，能够修复草甘膦所 诱导的细胞毒性损伤。 4. Hoechst33342 荧光染色观察核形态，正常对照组细胞呈均匀荧光淡染，胞核呈 圆形，草甘膦 90μg/ml 损伤细胞 24h 后，可见部分细胞出现致密结构、核固缩裂解， 进行 TUNEL 细胞凋亡检测，经过茶多酚 10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml 预 处理 24h，凋亡细胞形态学改变有所改善，细胞凋亡率明显降低，与草甘膦组比较 差异显著 (P0.05, P0.01)。 5．检测细胞损伤指标，与正常对照组比较，草甘膦损伤组细胞内 LDH 释放量增 高、SOD、GSH-Px 活性降低、MDA 含量增高。经过茶多酚预处理后 LDH 释放明 显减少、SOD、GSH-Px 活性明显提高，MDA 含量明显降低（P0.05，P0.01）。 6．半定量 RT-PCR 分析，草甘膦损伤后支持细胞 ABP mRNA、Vimentin RNA 表 达明显减弱；经过茶多酚 40μg/ml、80μg/ml 预处理 12h 后，支持细胞 ABP mRNA、 Vimentin RNA 表达明显增强(P0.01)。 结论： 1.90μg/ml 浓度的草甘膦染毒支持细胞 24h，可明显抑制支持细胞的活性。 2.茶多酚在 10 μg/ml～80 μg/ml 浓度范围内预处理支持细胞 12h，对草甘膦造成的 支持细胞损伤具有明显的保护作用，且具有时间依赖剂量依赖趋势。 3.茶多酚能明显拮抗草甘膦诱导的支持细胞损伤，可提高支持细胞活力，改善受 损细胞形态，降低支持细胞凋亡指数，抑制支持细胞凋亡，并且减轻支持细胞受 损程度、提高抗氧化酶活性同时减少脂质过氧化物生成，总体提高细胞抗氧化能 力，同时增强 ABP mRNA、Vimentin mRNA 表达。 关键词：茶多酚；草甘膦；睾丸支持细胞；氧化损伤；细胞凋亡 Protective Effect of Tea Polyphenols on the Damage in Mouse Sertoli Cells Induced by Glyphosate Abstract Objec