茶枝柑皮多糖提取、分离纯化、结构及抗氧化活性研究-药物分析学专业论文.docxVIP

广东药学院硕士研究生学位论文 广东药学院硕士研究生学位论文 I I 摘要 茶枝柑皮是茶枝柑（Citrus reticulata ‘Chachi’）的成熟果皮，果皮晒干陈化后， 便成了广东道地药材——广陈皮。茶枝柑皮主要是药用（作为广陈皮）、制成调味品 及凉果，除了含有挥发油、黄酮外，茶枝柑皮还含有丰富的果胶多糖，历来对茶枝 柑皮未进行深加工，造成资源的浪费。本论文以茶枝柑皮为原料，利用现代分离分 析手段，对茶枝柑皮果胶多糖的提取、纯化工艺、单糖组成的测定方法、化学结构 及其体外抗氧化活性进行了较系统的研究，以期为茶枝柑资源的开发利用提供科学 依据和利用途径。 1. 采用酸水提醇沉法提取茶枝柑皮粗多糖（CCP）。单因素试验确定各因素（提 取溶剂 pH 值、料液比、提取温度和时间）对多糖得率和抗氧化能力影响的合适水 平，并用正交试验进一步优化。经试验得出 CCP 的最佳提取工艺为：用 pH4 的酸 水、料液比为 1：30、提取温度 90℃、提取时间 90min，在此条件下多糖得率和抗氧 化 FRAP 值分别为 18.9%和 48.9。粗提多糖膨胀力和持水力均较高，并属于高酯果胶 多糖。 2. 将 CCP 通过树脂脱色和 Sevag 试剂去除蛋白，得到纯化的多糖 CP。通过静态 吸附法，考察了大孔吸附树脂、离子交换树脂对 CCP 溶液的脱色率，由于 D-201 阴 离子交换树脂脱色效果优于其它树脂，故选择 D-201 树脂作为 CCP 的脱色树脂，并 进一步研究了 D-201 树脂的最佳脱色工艺：脱色温度 40℃，树脂用量 8%（m/v）， 转速 75r/min 振荡 2h。Sevag 法除蛋白则需在反复萃取 6～9 次后，达到蛋白去除率为 74%。 3. 采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）作为还原醛糖的标识分子，柱前衍生 化高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）和普通 C18 柱，建立了 8 种常见单糖的快 速分析鉴别技术，并且确定了单糖的衍生化条件及多糖 CP 的水解条件。CP 用 2 mol/L 的三氟乙酸（TFA）在 120℃烘箱中水解 2h 得到各单糖，单糖在 70℃下与 PMP 衍生化反应 40min 后用 1：1（v/v）氯仿涡旋萃取 3 次。流动相 20%（v/v）乙腈-磷酸 盐缓冲溶液（pH 7.1）、流速 1.0 mL/min、等度洗脱即可实现单糖的良好分离。方法 学考察结果表明，各单糖的相关系数、精密度、重复性、回收率均良好。 4. 对纯化后的茶枝柑皮多糖 CP 采用 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析进 II II 行分离得到 4 个组分，分别命名为 CPN、CPA-1、CPA-2、CPA-3，将 CPA-1、 CPA-2、CPA-3 进一步用 Sephadex G-100 凝胶排阻层析纯化得到对应的 CPA-Ⅰ、 CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ。经 TSK G-5000 PW xL、TSK G-3000 PW xL 柱高效凝胶色谱分 析，证实 CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ具有较高的纯度，其重均分子量分别为 8.0×104 Da、2.6×105Da、2.4×105Da。红外光谱结果表明，CPN 是带有结晶水的吡喃多糖， CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ和 CPA-Ⅲ均是部分羧酸甲酯化的 α-半乳糖醛酸多聚糖。NMR 结果 推测茶枝柑皮多糖主链是由(1→4)-α-GalpA 构成，存在部分半乳糖醛酸甲酯化，半乳 糖、鼠李糖、甘露糖等以 α-吡喃糖形式存在于末端或侧链。 单糖组成分析表明，CPN 中单糖的摩尔比是 Man: Rha: GalA: Glc: Gal: Xyl: Ara =0.34: 0.07: 5.30:1:4.71:0.61:14.7；CPA-Ⅰ的单糖摩尔比是 Man: Rib: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara = 0.12: 0.04: 0.74: 39.33: 1: 8.48: 24.05；CPA-Ⅱ的单糖摩尔比是 Man: Rib: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara=0.94: 0.05: 1.33: 56.65: 1: 7.04: 19.38；CPA-Ⅲ的单糖摩尔比 是 Man: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara=2.02: 1.98: 122.66: 1: 8.85: 26.26。 5. 通过体外模拟试验，采用 MTT 法首先筛选了 H2O2 致 U251 细胞损伤的最佳 成模浓度，是 0.1875mmol/L；再研究了茶枝柑皮粗多糖（CCP）对过氧化氢损伤的 U251 细胞的保护作用，在试验浓度 2.500-0.078mg/mL 范围内呈剂量依赖关系；CCP 脱蛋白后的多糖则未表现出抗氧化活性。