茶树MEP途径中HDS与HDR基因的cDNA全长克隆、功能分析与表达特征研究-茶学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 萜类化合物（Terpenoids）是一类由异戊二烯为基本结构单元构建的化合 物，是茶树次生代谢物的重要的组成部分，在茶树间接防御中起到相当重要的 作用。而 4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶（HDS）、4-羟基-2-甲基-2-E- 丁烯基-4-焦磷酸还原酶（HDR）参与萜类物质代谢上游途径之一的 MEP 途径 中最后两步反应，且 HDR 还是 MEP 途径的关键限速酶之一，然而茶树体内 HDS、HDR 基因信息及其相关功能至今未见报道。本论文主要对茶树叶片中 的 HDS、HDR 基因进行了 cDNA 全长克隆、功能分析及其在不同组织器官与 逆境下表达特征的研究。主要结果如下： 1．课题组前期构建了茶树被茶尺蠖取食诱导前后的 cDNA 消减杂交文库 （SSH），并分离得到 2 条分别与 HDS、HDR 基因同源性很高的 EST 序列，基 于此，利用 RACE 技术分别获得了各自的全长 cDNA 序列，分别命名为 CsHDS 和 CsHDR。CsHDS 的 cDNA 全长为 2603bp，开放阅读框 2226bp，编码 741 个氨基酸；CsHDR 的全长 1716 bp，开放阅读框 1380 bp，编码 459 个氨基酸， 并 将 上 述 两 个 基 因 的 序 列 递 交 到 GenBank ， 登 录 号 分 别 为 JQ014629 与 JQ014628。 2．生物信息学分析表明， CsHDS 含有 2 个保守的 GcpE 功能域与 3 个半 胱氨酸残基活性位点；CsHDR 包含 1 个保守的 LYTB 功能域与 4 个保守的半 胱氨酸残基活性位点；两者均含一段叶绿体转运肽。 3. 组织特异性表达分析表明，CsHDS 在成熟叶中表达量最高，是芽的 3.09 倍，而 CsHDR 在成熟叶、花瓣与根中的表达量均很高，是芽的 2.24-2.56 倍， 但是两个基因表达量均在嫩茎中最低，分别是芽的 0.62 与 0.57 倍。 4．茶树被茶尺蠖取食后，CsHDS 与 CsHDR 的表达量均有显著上调且上 调趋势一致，均在茶尺蠖取食后 24 h 表达量上调至最高值，分别为对照的 10.31 倍与 7.13 倍，但在取食后 48 h 时，其表达量均降至与对照相当；茶树叶片受 机械损伤处理后，二者的表达量皆被诱导上调，但上调幅度明显低于被茶尺蠖 取食处理后的诱导表达量；经 5 倍稀释的茶尺蠖口腔分泌液处理后发现，两个 基因的表达量均在处理后 6 h 显著上调，分别为对照的 2.01 倍与 3.46 倍。 5. 经茉莉酸甲酯（MeJA）处理后 6 h，CsHDS 表达量上调到对照的 2.31 倍，之后降至与对照的表达水平相当，而 CsHDR 则在处理后 6 和 24 h 表达量 明显高于对照；经水杨酸（SA）处理后 12 h，CsHDS 与 CsHDR 的表达量均被 诱导上调，分别是对照的 1.92 与 1.71 倍，在其它时间段内，前者的表达量明 I II 显低于对照，而后者与对照没有明显的差异，但是两者各自的最大表达量随着 激素种类的不同而存在差异；经 ABA 处理后，CsHDS 在各时间点表达量均显 著低于对照，而 CsHDR 除了处理后 6 h 以外，其它时间点也表现类似规律； 经推荐浓度的吡虫啉喷施处理后 4 d，CsHDS 的表达量显著上调，而 CsHDR 则相反。 关键词：茶树；CsHDS；CsHDR；茶尺蠖；基因克隆；表达特征 PAGE PAGE III Abstract Terpenoids are a class of compounds which constructed from their basic structural unit- isoprene. Terpenoids is an important part of secondary metabolites in tea plant, and their also plays an important role in indirect defense. 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase (HDS), 4-hydroxy-3-methyl- but-2-enyl diphosphate reductase (HDR), the two above-mentioned participate in the last two steps of the MEP pathways which is upstream biosynthesis pathway in terpenes metabolism. The HDR is also a cri