多能干细胞关键转录因子Nanog和Oct4的RNA结合蛋白的鉴定和研究-遗传学专业论文.docx

多能干细胞关键因子 多能干细胞关键因子 Nanog 和 Oct4 RNA 结合蛋白的鉴定和研究 万方数据 万方数据 多能干细胞关键转录因子 Nanog 和 Oct4 的 RNA 结合蛋白的 鉴定和研究 中文摘要 多能干细胞有一种独特的特性就是它们可以进行自我更新并且可以分化成 所有细胞类型。多能干细胞干性维持机制一直是科学家们研究的热点，之前的 研究主要集中在转录因子如何与下游靶基因相互作用从而调控一系列多能性基 因和分化基因的表达这一方向，这些转录因子包括 Oct4，Nanog，Sox2。他们 组成了控制多能干细胞转录调控网络的转录复合体中心。这个转录调控复合体 跟其他的转录因子在维持多能干细胞多潜能性方面共同起着基础性的调控作 用。 随着研究的进行，人们发现转录后调控过程对于真核基因的表达有着更强 烈的影响，这一过程通过特异性针对 mRNA 的方式调控着 mRNA 代谢的每一 个阶段，包括选择性剪切，核转运，mRNA 代谢，细胞分裂，定位和翻译等步 骤。另外值得注意的是，在早期胚胎发育过程中通常是没有转录行为发生的， 而细胞分裂、细胞命运决定等细胞内一系列重要决定也是在早期胚胎发育过程 中做出的。正是由于这个原因，早期胚胎发育过程和干细胞自我更新过程中基 因的表达调控主要依赖于转录后水平调控来进行的。 我们的研究正是从转录后水平调控入手探讨调控多能干细胞多能性维持和 分化基因表达的可能性机制，在转录后调控中 mRNA 代谢是由一系列 RNA 结 合蛋白与靶基因 mRNA 相互作用实现的。因此我们选择 Nanog 这个多能干细胞 关键转录因子作为我们的研究对象，通过鉴定和验证 Nanog 的 RNA 结合蛋白， 并分析这些 RNA 结合蛋白对于多能干细胞多能性维持的功能性作用，继而分析 它们的 RNA 结合蛋白是怎样通过转录后调控来控制 Nanog 的 mRNA 代谢过程 的。同时我们也初步鉴定了与 Oct4 相互作用的 RNA 结合蛋白，为以后研究 Oct4 转录后调控网络奠定基础。 我们首先用体外链霉素标签亲和层析技术分离了 Nanog 和 Oct4 的 RNA 结 合蛋白，并且用高效液相色谱和质谱鉴定出了 Nanog 118 个 Nanog 的 RNA 结 合蛋白和 114 个 Oct4 的 RNA 结合蛋白。继而又重点从 Nanog RNA 结合蛋白中 根据功能和肽段匹配分值筛选出 8 个最可信的 RNA 结合蛋白做进一步验证和功 能研究，Western Blot 验证 8 个候选 RNA 结合蛋白证明与质谱鉴定出的结果是 一致的，RNA 免疫共沉淀验证这些候选 RNA 结合蛋白确定在细胞内部也与 Nanog RNA 有相互作用关系，我们还用体内分离 RNA 结合蛋白的方法即 MS2-BioTRAP 亲和纯化技术来获取与 Nanog mRNA 在细胞内部相互作用的 RNA 结合蛋白，之后对体内方法获取的 RNA 结合蛋白进行 Western Blot 验证 初步证实了其中确实含有体外方法鉴定得到的候选 RNA 结合蛋白。其中我们挑 选了 2 个在 RNA 免疫共沉淀验证中被认为与 Nanog RNA 结合能力最强的 RNA 结合蛋白 YBX1 和 ILF3 作为对多能干细胞多潜能性维持是否有功能性调节作用 的关键基因进行验证，我们采用了 RNA 干扰的方法降低 YBX1 和 ILF3 基因表 达量，分析它们对小鼠多能干细胞多潜能性基因和分化基因表达的影响，结果 证明干扰 YBX1 和 ILF3 基因表达会明显降低小鼠多能干细胞多潜能性基因的表 达量，同时可能会导致多能干细胞向中胚层分化，之后 ILF3 干扰细胞的全基因 组芯片研究表明表达量变化明显的基因很多都是关键转录因子 Nanog，Oct4， Sox2 靶向结合的基因，因此我们推测干扰 ILF3 可能对转录因子 Nanog，Oct4， Sox2 的下游靶向作用基因的影响很大，同时在一定程度上也说明了转录因子的 上游调控元件可能是通过调节转录因子的表达继而控制下游基因的表达的。而 根据之前研究提出的结论，Nanog 是由 Oct4 和 Sox2 转录因子调控的，我们的 研究发现 ILF3 作为 Nanog 的上游调控因子（RNA 结合蛋白），同时还是 Oct4 和 Sox2 的下游靶基因，因此我们推测 Oct4 和 Sox2 可能是通过调控 ILF3 的表 达间接控制 Nanog 基因表达的。 英文摘要 Embryonic stem cells have a unique capacity to self-renew and differentiate into all cell types. Several transcription fact