灿烂弧菌的鉴定及溶血素检测-预防兽医学专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 海洋灿烂弧菌的鉴定及溶血素的检测 海洋灿烂弧菌的鉴定及溶血素的检测 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中 文 摘 要 海水养殖动物的弧菌病(Vibrio)是一种流行范围广，危害严重的传染性疾病。 其中灿烂弧菌是致病菌之一。灿烂弧菌是海水动物的重要致病菌，可引发大菱鲆、 牙鲆、大西洋鲑、鳟鱼、鲈鱼等患多种疾病，可引起尾部有出血点，皮肤腐烂，严 重的形成溃疡；背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血；肝脏肿大，糜烂；肾脏糜烂等 症状。还可引起刺参腐皮综合征。 弧菌溶血素被认为是主要的致病因子之一。但是，针对于灿烂弧菌致病因子的 相关研究报道较少。国外曾有针对灿烂弧菌的金属蛋白酶缺失自杀载体的试验研究 报道, 但以灿烂弧菌的溶血素基因 4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （4HPPD）为对象的研究尚未见报道。本研究以纯化的灿烂弧菌外毒素和灿烂弧 菌溶血素基因 4HPPD 原核表达蛋白为对象，以此菌致病的致病因子进行了分析。 获得的结果如下： 1 青岛某美国红鱼养殖场中患溃烂症的美国红鱼分离到优势菌株 QD-1，人工 感染实验证实该菌为美国红鱼的致病菌。对该细菌进行了形态学、生理生化特性分 析，同时对菌株 QD-1 进行了分子生物学的鉴定，命名为灿烂弧菌 QD-1 菌株 （Vibrio splendidus QD-1）。 2 细菌致病性的检测：溶血性测定：将脱纤维羊血按5%的体积加入Zobell 2216E海洋培养基中制成羊鲜血平板,28 ℃过夜培养。菌落周围出现半径为2mm溶 血环。磷脂酶活性测定：配制Zobell 2216E固体培养基,加入体积分数为1%的新鲜 蛋黄,制成平板。在菌落周围出现半径为0.5mm乳白色半透明圈。从以上两个实验中 可以看到灿烂弧菌的溶血性较强，而磷脂酶的活性测较弱，这可能是与菌株的不同 有关。人工感染实验:在水族箱中，每箱放养健康孔雀鱼10尾。致病性试验共分6 组，5个实验组和1个对照组，每组10尾鱼，实验组的细菌浓度分别为2×104 cfu /mL，2×105 cfu /mL，2×106 cfu /mL，2×107 cfu /mL，2×108 cfu /mL，对照组为 ％的灭菌生理盐水，采用腹腔注射，注射剂量0.20 mL/尾。饲养水温27.4 ℃-28 ℃，连续观察7 d，随时记录鱼的发病症状及死亡情况。应用简易Korbor’s法计算出 LD50为 5.62×105 cfu/mL。 3 灿烂弧菌挑取单个菌落接种50mL海水培养基中，于28℃增菌18h后, 再按1% 量转种至1L海水培养基中，200rpm，振荡48h。硫酸铵沉淀：培养物经离心取上清 加入固体硫酸铵至70%的饱和度，离心后用浓度为50mmol/L的Tris-HCL (pH=7.8) 缓冲液溶解, 用相同缓冲液4℃透析48h,将其浓缩后即为粗提外毒素。Sephadex- G100层析: 粗提外毒素加入Sephadex-G100层析柱中，用缓冲液洗脱, 流速为6滴 /min,每2mL收集一管,测定OD值，将最高峰值处的蛋白收集液，用PEG-100浓缩, 即为纯化外毒素。经SDS法测得分子量为40.7 kD。通过考马斯亮蓝法测得纯 化蛋白的含量为0.8 mg/mL。取提纯溶血素作原液，10，100,1000倍稀释后无菌过 滤, 分四组。每一稀释度腹腔注射孔雀鱼5尾,每尾注射0.1mL, 室温观察48h, 记录实 验鱼死亡数, 按简易Korbor’s法计算LD50为6.35 μg。结果表明，这是一株有致病性 的灿烂弧菌。 4 将溶血素基因4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (4HPPD)构建于表达载体 pGEX-6P-I，经过一系列的条件摸索后，最终确定加入IPTG至终浓度0.8mmol/L， 30℃，200rpm，振荡4h为最佳诱导条件。将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗， 将QD-1菌株纯化外毒素抗原稀释至16ug/mL，抗体稀释160倍测得P/N比值最大 （阳性血清OD值为0.591，阴性对照值为0.058）。P/N=10。通过间接ELISA测 定，免疫小鼠抗溶血素抗体滴度为1:3200。中和溶血素试验根据，将溶血素无菌过 滤后分别分成10,100倍稀释组和纯化溶血素原液组，分别与20倍稀释免疫小鼠血清 等量混合，室温作用1h。接种混合物的孔雀鱼，原液组全部死亡，10倍稀释抗原组 死亡两尾，100倍稀释抗原组死亡1尾。 关键词：灿烂弧菌；致病性；溶血素；原核表达；免疫中和试验 Identification and Hemolysin of Vibrio splendidus isolates Abstra