草鱼Ajuba蛋白在草鱼呼肠孤病毒感染CIK细胞过程中的表达及功能探讨-临床兽医专业论文.docxVIP

上海海洋大 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 答辩地点 答辩日期 草鱼 Ajuba 蛋白在草鱼呼肠孤病毒 感染 CIK 细胞过程中的表达及功能探讨 摘 要 Ajuba 属于 LIM 蛋白第三类中的 Zyxin 蛋白家族，含有双锌指结构的 LIM 结 构域，其主要作用是参与蛋白质之间的相互作用。Ajuba 影响着生物体生长发育的 基本过程——有丝分裂，调控细胞周期；是细胞骨架相关蛋白，参与细胞粘附及 细胞间的信息交流；作为转录共抑制因子，参与调解不同的生理过程，甚至与肿 瘤的发生相关。而且，Ajuba 参与核转录因子蛋白家族 NF-κB 的激活反应，NF-κB 能够调控很多与早期免疫反应和炎症反应相关的分子。草鱼呼肠孤病毒引发的草 鱼出血病，危及中国淡水养殖业，给渔民造成极大的损失。针对草鱼呼肠孤病毒 分子结构及基因功能的研究是明确病毒侵染宿主机制的基础，而对草鱼呼肠孤病 毒蛋白与宿主蛋白的相互作用研究则是攻克草鱼出血病的重点和难点。 基于此，本课题主要从以下几个方面进行研究： 1. 草鱼 Ajuba 基因的克隆与表达 根据酵母双杂交技术获得的基因片段设计特异性引物，结合 RACE 技术，扩 增得到草鱼 Ajuba 基因（gcAjuba）cDNA 全长 3980 bp，GenBank 登录号为 KC551289.1。其中，5’非编码区 1215 bp，3’ 非编码区 644 bp，开放阅读框（ORF） 2121 bp，编码 706 个氨基酸，分子量约为 75.966 kDa。等电点（pI）为 7.87，不 稳定系数为 64.48。生物学分析，蛋白 gcAjuba 含有 3 个碳末端保守 LIM 结构域。 氨基酸比对发现，gcAjuba 与斑马鱼 Ajuba 氨基酸序列同源性最高，与哺乳动物 Ajuba 也具有较高的同源性。系统进化分析显示，gcAjuba 与鱼类亲缘关系最近， 与哺乳动物亲缘关系最远。 2. GCRV-JX01 感染下 gcAjuba 基因的表达研究 为明确草鱼呼肠孤病毒感染条件下 gcAjuba 的表达模式，设计实验检测 gcAjuba 在 GCRV-JX01 感染后 0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 五个时间点转录水平表达 情况，使用相对定量的方法，以草鱼 EF1a 为内参基因，检测 gcAjuba 基因在不同 时间的表达水平差异。结果显示，gcAjuba 在 GCRV-JX01 病毒毒株感染刺激后 4 h 达到最高表达量，且明显上调。说明 gcAjuba 基因是一个病毒可诱导基因，参与草 鱼呼肠孤病毒侵染宿主途径。 3. 草鱼 Ajuba 与 GCRV NS26 相互作用的初步探究 成功构建重组质粒 pEGFP-gcAjuba 和 pcDNA3.1-NS26，共转入草鱼 CIK 细胞。 亚细胞定位显示，草鱼蛋白 gcAjuba 和病毒蛋白 NS26 均分布于细胞质中，但两者 I 表达位置并没有完全重叠。应用免疫共沉淀技术，证明融合蛋白 GFP-gcAjuba 和 His-NS26 之间没有直接相互作用。 本研究成功克隆草鱼 Ajuba 基因，首次获得草鱼 Ajuba cDNA 序列全长，并对 其蛋白序列进行结构与生物学分析，为进一步探究草鱼 Ajuba 的生物学功能做好 铺垫。而且证明 gcAjuba 是草鱼呼肠孤病毒感染细胞下的可诱导蛋白，结合 Ajuba 参与免疫系统这一论断，为草鱼呼肠孤病毒的防控机制提供新的思路。然而，由 酵母双杂交实验得出的 gcAjuba 与 NS26 的相互作用在体外实验中并未得到验证。 可能需要从 Ajuba 蛋白自身的生物学修饰或者某种间接激活物等方面考虑，进一 步完善后续研究。 关键词：Ajuba，草鱼，RACE，GCRV，可诱导基因，亚细胞定位 ABSTRACT Ajuba belongs to the Zyxin family and the third group in LIM domain proteins, which containing double structure of zinc finger domains.The main function of the LIM proteins was participated in the interactions between different proteins. Ajuba is one of the important LIM domain proteins, which involved in assembling the extracellular matrix and taking along wit