产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测-预防兽医学专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌 α 毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测 中文摘要 为了认识 α 毒素在感染产气荚膜梭菌动物体内的分布，深入探讨产气荚膜梭菌的肠 源毒血症的致病机理，本实验自制了高效价的产气荚膜梭菌 α 毒素的多克隆抗体，并以 此作为一抗采用免疫组织化学方法对人工感染产气荚膜梭菌病的小鼠体内的 α 毒素进行 了定位，阐明了产气荚膜梭菌毒素的分布状况，揭示了家畜猝死症的致病机理。 首先在厌氧条件下培养复活了 A 型产气荚膜梭菌标准菌株，提取 DNA 模板，设计 特异性的引物，并对其 α 毒素的全长基因进行 PCR 扩增、克隆。以常规基因重组技术, 将回收的目的基因片段插入原核表达载 pET28a，得到重组质粒, 经酶切、测序鉴定后， 用该重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)，转化完成后，用 IPTG 诱导表达，摸索诱导最 优条件后，将最佳条件下的诱导产物进行 SDS电泳，并经镍柱亲和纯化目的蛋白； PBS 透析，Western blot 检测了蛋白的特异性。 将表达并纯化的 α 毒素蛋白 500 μg 混以免疫弗氏佐剂免疫家兔四次，定期取血清并 用 ELISA 方法检测抗体滴度，获得多克隆抗体。 将产气荚膜梭菌接种产毒培养基，厌氧环境 45C、4h 培养，取培养液常规硫酸铵法 提取外毒素，用灭菌生理盐水稀释，腹腔皮下注射小鼠，取 72h 内死亡小鼠的器官组织： 心、肝、脾、肺、肾、胃，小肠、延脑，投入 4%多聚甲醛中固，然后制作组织切片， 用自制的兔抗 α 毒素多克隆抗体作为一抗，ＨＲＰ（辣根过氧化物酶）和ＦＩＴＣ（荧 光素）分别标记的羊抗兔 IgG，作为二抗。通过免疫组织化学法对患产气荚膜梭菌病的 小鼠体内的 α 毒素进行了定位检测。 结果表明，PCR 扩增出长度为 1228 bp 的产物，通过 Blast 比对，确认为 α 毒素基因； 对表达载体 pet28a 和含有目的基因的重组 T 载体分别进行双酶切，并将酶切后的线性 pet28 回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接，成功构建了 pet28a-α 表达载体。 经 IPTG 诱导、表达产物经 SDS电泳，获得大小为 45KD 特异的表达条带，表达 量可达 42.1%。Western blot 结果证明表达的目的蛋白具有高度的特异性。 以表达的 α 毒素蛋白为抗原，四次免疫家兔后，获得得多克隆抗体经 ELISA 测定， 其效价为 1 : 512,000。经免疫组织化学法对器官的毒素分布检测指出，在小鼠的延髓、 肠、肾、肺、胃的组织细胞胞浆中发现了阳性颗粒，说明 α 毒素随血液循环系统进入并 侵害了动物的延髓、肠、肾、肺、胃等组织。在脾、肝的血管内发现阳性颗粒，但在主 质细胞中未发现毒素分布，说明毒素无法侵害脾肝的主质细胞。研究显示，本实验成功 的制备了高效价的兔抗 α 毒素多克隆抗体，免疫组化结果提示，首次在延髓的细胞胞浆 中发现了 α 毒素，延髓是生命中枢、呼吸、心血管中枢，毒素的侵害使其紊乱，加之毒 素对消化系统呼吸系统及肾脏的毒害作用，导致动物死亡。 关键词：产气荚膜梭菌；α 毒素；家畜猝死症及其机理；多克隆抗体；免疫组化；HRP 标记；FITC 标记 The Distribution of α-toxin in Mice Organs Infected Clostridium perfringens Abstract In order to understand the distribution of α-toxin of animals infected Clostridium perfringens and deeply study the pathogenic mechanism of Clostridium perfringens intestinal toxemia, this experiment made the high price antibody of Clostridium perfringens α-toxin, and take the take the antibody as the first antibody to locate α-toxin in mice infected Clostridium perfringens by the method of immunohistochemistry to explain the distribution of α-toxin and reveal the pathogenic of Sudden Dea