超临界流体技术制备丝素聚乳酸复合组织工程支架的研究-生物化工专业论文.docx

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘要 组织工程支架的构建是组织工程的核心问题之一，其涉及生物材料的选择 和支架的制备工艺。丝素/聚乳酸复合材料具有良好的细胞亲和性、生物相容性、 机械强度和可调生物降解速率等一系列特点，在组织工程领域得到广泛的应用 和研究；超临界二氧化碳技术在组织多孔支架的制备方面也具有独特的优势。 本文以碳酸氢铵为致孔剂，采用超临界二氧化碳相分离法分别制备了聚乳 酸及丝素/聚乳酸复合支架，并研究其生物相容性、载蛋白类大分子的释放情况 及拓扑结构对细胞的影响。 首先，以碳酸氢铵为致孔剂，采用超临界二氧化碳相分离法制备了聚乳酸 多孔支架。先通过 Minitab 实验设计，主要考察了聚乳酸粘度、碳酸氢铵尺寸和 碳酸氢铵/聚乳酸比例对聚乳酸多孔支架孔隙率和压缩强度的影响。实验结果表 明，二氯甲烷作溶剂，在聚乳酸粘度为 3.5 dl/g，碳酸氢铵颗粒尺寸为 300~600 μm， 碳酸氢铵/聚乳酸比例为 20 的条件下，制得的聚乳酸多孔支架孔隙率高（95%）、 压缩强度好（100 kPa）。在优化后的条件下，考察超临界二氧化碳相分离操作 条件（温度、压力和时间）及不同溶剂对多孔支架内部形貌的影响，结果表明， 随着温度（35~45℃）的升高，聚合物-溶剂之间的相互作用增强，支架趋于形成 不均一的网状结构；随着压力（10~20 MPa）的增大，二氧化碳的密度和溶剂力 增强，聚乳酸支架孔隙率和孔洞尺寸增大；随着相分离时间（0.5~1.5 h）的延长， 聚合物贫相生长时间增加，聚乳酸支架孔洞尺寸增大。聚乳酸溶于二氯甲烷， 经相分离后制得的支架具有大孔结构，孔洞尺寸梯度分布，壁面光滑；聚乳酸 溶于二氧六环，经相分离后获得具有纳米纤维网状结构的支架；聚乳酸溶于二 氯甲烷/二氧六环混合溶剂，经相分离后制备的支架具有大孔、小孔共存，孔洞 相互贯通的网状结构。顶空气相色谱检测支架中二氯甲烷和二氧六环残留量分 别为 12 ppm 和 17 ppm，远低于 USP 467 药典规定的上限（600 ppm 和 380 ppm）， 体现了超临界流体技术制备多孔支架所具有的有机溶剂残留量低的特点。红外 光谱、X-射线衍射和差热分析表明，聚乳酸经超临界二氧化碳处理后，化学结 构、官能团、晶型、玻璃化温度及熔点等均未见明显变化。聚乳酸负载溶菌酶 经超临界二氧化碳处理后，活性仍然可以保持在 95%以上。 I 华侨大学博士学位论文 华侨大学博士学位论文 其次，以碳酸氢铵为致孔剂，采用超临界二氧化碳相分离法制备了丝素/聚 乳酸多孔支架。先采用超临界流体强制分散法制备丝素纳米颗粒，考察喷嘴尺 寸、压力、溶液浓度、溶液流速、二氧化碳流速等因素对丝素纳米粒径的影响。 实验结果表明，将 0.5%（w/v）的丝素六氟异丙醇溶液，在压力 10 MPa、 温度 35℃和二氧化碳流速 1500 L/h 的条件下，以 0.5 mL/min 的流速经喷嘴（150 μm） 进入高压釜，制得的丝素粒径分散性和球形度好，平均粒径为 296.5 nm，纳米 颗粒表面电负性强。丝素经超临界处理后，化学结构、官能团没有明显变化， 结晶度和玻璃化温度升高，分解温度略有降低。丝素纳米颗粒载溶菌酶试验表 明，随着投药量的增大，载药量增大，包封率降低，最大载药量和包封率分别 为 12.7%和 74.4%。经丝素负载后溶菌酶具有一定的缓释性能，且酶活力得到保 持。将丝素纳米颗粒和聚乳酸复合后经超临界相分离制备了丝素/聚乳酸复合支 架，随着丝素纳米颗粒含量的增加，复合支架孔隙率由 94.5%降到 91.8%，压缩 强度由 123.5 kPa 增到 176.6 kPa；复合支架中溶菌酶的缓释性能得到进一步提高， 650 h 累计释放率为 54.4%，且药物释放浓度和丝素纳米粒的载药量线性相关。 然后，对丝素/聚乳酸复合支架进行了生物相容性评价。细胞增殖试验表明， 复合支架材料浸提液对细胞生长无抑制作用，细胞形态良好、贴壁正常，细胞 的相对增殖率大于 80%，属于 1 级水平。全身急性毒性试验表明，小鼠经尾静 脉注射支架浸提液后，生长状况良好，体重增加明显，表明复合支架材料为无 毒材料。细胞溶血试验表明，复合支架材料溶血率均低于 1.5%，具有良好的血 液相容性。动态凝血时间试验表明，在每个时间点，复合支架材料的吸光值高 于对照组，说明复合支架材料组具有良好的抗凝血性能。 最后，研究了丝素/聚乳酸复合支架及聚乳酸支架纳米拓扑结构对细胞的影 响。结果表明，丝素纳米颗粒的加入不仅增加了复合支架的表面粗糙度，而且 改善了聚乳酸支架的细胞亲和性。随着丝素纳米颗粒的增加，丝素/聚乳酸复合 支架对蛋白的吸附、细胞的粘附以及支架粘附细胞的蛋白分泌量均呈现先上升 后下降的趋势，且与聚乳酸支架具有显著性差异（p0.01