产碱假单胞菌降解地塞米松相关蛋白酶的研究-病原生物学专业论文.docxVIP

重庆医科 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 英文全称 中文全称 CCTCC China Center for Type Culture Collection 中国典型培养物保藏中心 kDa Kilodalton 千道尔顿 CFU Colony forming unit 菌落形成单位 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 SDS sodium dodecyl sulfate,sodium salt 十二烷基硫酸钠 DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 PAGE Polyacylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 BCA Bicinchoninic acid 2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠 pH Hydrogen ion concentration 氢离子浓度指数 mol Miocromole 摩尔 LB Luria-Bertani LB 培养基 OD Optical density 光密度 BLAST Basic Local Alignment Search Tool 基于局部比对算法的搜索工具 NCBI National center for biotechnology information 美国国立生物技术信息中心 HPLC High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱 TEMED Tetramethylethylenediamine 四甲基二乙胺 g Gram 克 min minute 分钟 L Liter 升 d Day 天 1 产碱假单胞菌降解地塞米松相关蛋白酶的研究 摘 要 目的：本文在从医院废水中分离到一株可降解地塞米松磷酸钠和地 塞米松的产碱假单胞菌的基础上，进一步分离提取与该菌降解有关的蛋 白酶，并探讨其特性，为制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物 净化剂奠定基础。 方法：将分离的降解地塞米松的产碱假单胞菌在地塞米松磷酸钠 培养液长期反复培养训化，以提高该菌对地塞米松的降解率。再用渗透 休克法提取该菌的胞外蛋白、周质蛋白和胞内蛋白，SDS电泳分 析提取的各部位蛋白，对主要蛋白进行质谱鉴定。用高效液相色谱法 （HPLC）检测各部位蛋白的降解酶活性，以确定降解酶存在的部位。 对具有酶活性的胞内蛋白先用硫酸铵盐析，再用离子交换层析与葡聚糖 凝胶层析相结合的方法进一步提取纯化。用 HPLC 法检测在纯化过程中 蛋白酶的降解活性，用 BCA 法检测蛋白浓度，再计算出比活力，纯化 倍数及回收率。将纯化后的蛋白酶切后质谱鉴定，并测定其降解反应的 动力学特征。 结果：地塞米松降解菌经多次驯化后，对地塞米松磷酸钠的降解率 从驯化前的 50.89%提高到 75.7%，将地塞米松降解为其它物质的降解 率从 23.63%提高到 74.99%。驯化菌在驯化前后对地塞米松磷酸钠与地 塞米松的降解有显著的统计学差异（P 0.05）。在常规培养条件下对地 2 塞米松磷酸钠与地塞米松也有显著的降解作用。从驯化菌提取到分子量 约为 100kDa，41kDa 及 20kDa 三种主要蛋白质，质谱鉴定分别与 TonB 依赖性受体蛋白，异戊酰辅酶 A 脱氢酶和假定蛋白有较高的相似性。 驯化菌的胞内蛋白具有较高的降解酶活性。从胞内蛋白中提取纯化到 41kDa 蛋白，质谱鉴定与异戊酰辅酶 A 脱氢酶有较高的相似性。降解 酶在温度 25℃-40℃和 pH6.5-pH8.5 条件下具有较好的降解作用，酶促 反应动力学方程为 Ct= C0 e-0.1769t，符合一级动力学方程。 结论：本文成功驯化了所分离的地塞米松降解菌，明确了降解酶所 存在的部位。成功提取了驯化菌的主要蛋白，明确了这些蛋白的性质。 提取纯化了胞内蛋白中的降解酶，了解了酶蛋白的降解特性，构建了酶 促反应动力学方程。为进一步制备清除环境中地塞米松类药物污染的 生物净化剂提供了实验材料和理论基础。 关键词：产碱假单胞菌；驯化；地塞米松；蛋白质；降解酶；特性 3 RESEARCH ON PROTEASE ASSOCIATED WITH DEGRADATING DEXAMETHASONE IN PSEUDOMONAS ALCALIGENES ABSTRACT Objective：In order to lay the foundation for further preparation of bioremediation agents to get rid of dexamethasone pollution in water, based on a strain of Pseudomonas al