对虾WSSV和IHHNV病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法的研究-食品科学与工程专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学 硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 韩继刚 中科院上海辰山植 物科学研究中心 教授 主席 陈兰明 上海海洋大学 教授 委员 吕利群 上海海洋大学 教授 委员 严继舟 上海海洋大学 教授 委员 委员 委员 委员 喻勇新 上海海洋大学 秘书 答辩地点 食品学院 A209 答辩日期 2015-06-03 对虾 WSSV 和 IHHNV 病毒 重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法的研究 摘 要 对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus, WSSV）和传染性皮下及造 血组织坏死性病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV） 是对虾养殖业中最常见的两种主要病原微生物，可分别引起对虾白斑综合征和慢 性矮小短缺综合症(DRS)。这两种病毒具有毒力强、复制快、传播范围广、致死 率高等特点。自上世纪八十年代以来，这两种病毒性疾病的爆发，给全球对虾养 殖业造成了严重的经济损失。目前，对这两种病毒性疾病的防治和控制还尚无有 效药物，唯一阻止其快速爆发的有效方法，就是在对虾养殖过程中实施早期诊断 和提前预防的策略。 针对上述现状，本文以 WSSV 和 IHHNV 两种病毒为研究对象，旨在开发一 套基于重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）快速 检测 WSSV 和 IHHNV 的诊断方法。同时，从稳定性、重复性、灵敏度和检测时 间等方面对该方法进行系统分析，证实了其具有等温、快速、便携等特点，给对 虾样品 WSSV 和 IHHNV 等病原微生物的原位检测提供了技术支撑。本文研究结 果主要包括： （1）建立了一套针对对虾样品 WSSV 病毒的实时、快速、等温检测方法。 首先针对含有 WSSV 保守 DN A 片段（VP28）的重组质粒标准品，建立一套 RPA-WSSV 标准检测方法；然后采集不同养殖季节的对虾样本，提取其肝胰腺和 肌肉组织的总 DNA；利用 RPA-WSSV 方法对虾体中 WSSV 基因组进行检测，同 时与 qPCR（Mendoza-Cano F 等人构建）检测结果进行比较。结果显示，RPA-WSSV 方法在 7min 内 39℃条件下，可以快速检测出虾体中 WSSV 病毒 DNA，其灵敏度 达到 10 个分子，表明 WSSV-RPA 检测体系是一个灵敏度高、特异性强和可靠性 好的分子诊断方法。 （2）建立了一套针对对虾样品 IHHNV 病毒实时、快速、等温的检测方法。 首先针对含有 IHHNV 基因组保守 DNA 片段的重组质粒标准品，建立一套 RPA-WSSV 标准检测方法；同样采集不同养殖季节的对虾样本，提取其肝胰腺和 I 肌肉组织的总 DNA；利用 RPA-IHHNV 方法对虾体中 IHHNV 基因组进行检测， 同时以 OIE 公布的标准 qPCR 检测方法作为对照。结果显示 RPA-IHHNV 方法同 样可以在 39℃条件下，7 分钟以内，对虾体中 IHHNV 病毒 DNA 进行快速检测， 其灵敏度达到 4 个分子，进一步表明 WSSV-IHHNV 检测体系是一个灵敏度高、 特异性强和可靠性好的分子诊断方法。 （3）RPA 引物和探针的设计是目前该方法成功的关键和瓶颈。本研究通过 设计多组 RPA 引物和探针，结合引物优化和筛选实验，较为系统地分析了 RPA 引物和探针的设计原则和相关机制。具体包括：在 5’端 3-5 个碱基处，最好是嘧 啶碱基（T/C），不要出现 G，嘧啶碱基利于引物与重组酶形成引物-重组酶复合体， 提高扩增效率； 3’端最好是碱基 G 或者 C，这样引物与模板之间结合更加稳定； 结合同一条模板的引物与探针之间应相差少量碱基，不能相隔太多碱基，也不能 有重叠。 总之，本研究应用 RPA 技术成功构建了 RPA-WSSV 和 RPA-IHHNV 快速检 测体系，随后对 RPA 方法进行深入分析并首次系统提出 RPA 引物设计基本原则， 为实现对虾样品中 WSSV 和 IHHNV 病毒的原位检测提供了一定的技术支持，具 有良好的应用前景。 关键词： 重组酶聚合酶扩增法，对虾白斑综合症病毒，传染性皮下及造血组织 坏死性病毒，检测 II Abstract White spot syndrome virus (WSSV) and Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) are lethal viruses to the shrimp farming., which had caused larg