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pMD?18-T Vector图谱 连接 1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。 pMD?18-T Vector*1 1 μl DNA 3.5 μl dH2O up to 5 μl 2）加入5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应30分钟。 转化 转化(Transformation)：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-, M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。  CaCl2转化原理 正在生长的大肠杆菌在0°C下加入到低渗的冰冷的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）。 感受态细胞与外源质粒DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNA酶抗性的羟基钙磷酸复合物。 42°C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。 转化步骤 1. 于超净台中取连接产物10μl与100μl大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中30分钟。 2. 42℃热休克90秒，置冰浴中3-5分钟。 3. 于超净台中加LB培养基900μl，37℃水浴1小时。 4. 4000rpm离心3分钟，弃上清，取残余液体重悬细菌。 4. 取l上述混合物均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。 5. 37℃孵箱培养12~16小时，可见长出单菌落。 6. 挑选单菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，或提质粒酶切、测序鉴定。 实验总体安排 ? 1．大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定： 大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测 GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶） RT-PCR产物的胶回收 连接入T载体、转化（GAPDH基因的TA克隆） 挑单克隆，摇菌过夜、提质粒 酶切鉴定，电泳检测 从组织中提取RNA 本实验目的：提取大鼠总RNA 组织来源：大鼠肝脏。 每组做两个样品 Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，用异丙醇沉淀RNA TRIZOL法提取总RNA原理 步骤 解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入1mlTRIZOL试剂。匀浆。 移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2ml，摇振15s，置室温2～3min。 4℃离心，12,000g×15min。 仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。 加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。 4℃离心，12,000g×10min。 弃上清，加75％乙醇1ml，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。 弃上清，空气干燥5-10min，加入50μl无RNase水重悬沉淀。 核酸定量或电泳检测。多余样品-70℃保存备用。 注意事项 抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理（配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌; 所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗涤; 经过DEPC水处理的器皿容器等，最后高温高压灭菌15分钟，以去除残留的DEPC。DEPC水有致癌性，操作时要小心）。 注意事项 RNase广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必戴手套。一旦接触与Rnase相关制品，应更换手套须 样品量和Trizol 的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则会使内源性RNase 的抑制不完全，导致RNA 降解。 电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用方法 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度。 RNA/DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正