病毒分子诊断范例培训教材.pptVIP

病毒分子診斷範例;最適生長溫度 33-35℃ 次易引發普通感冒的病毒 10-15％呼吸道感染、胃腸炎 嬰兒及兒童（冬天、春天） 僅有兩株分離的人類病毒株 HCoV-OC43, HCoV-229E 核酸：正股RNA、套膜、 80-160 nm 對酸、乙醚、乾燥較敏感 基因體 +RNA ： 27,000-30,000 nt (大腸桿菌 460萬bp) (人類 30億 bp) ;;SARS病毒的基因檢測 RT-PCR， Real-time RT-PCR 使用One-Step RT-PCR Kit將SARS病毒的RNA反轉錄成互補的cDNA，再進行PCR SARS檢驗陽性 SARS病毒PCR確認陽性 至少2種不同的臨床檢體(例如鼻咽檢體及糞便) ，呈陽性反應 同一種臨床檢體，但是在病程中不同的二天或多日所採取，呈陽性反應 使用原始臨床檢體，分別操作二種不同的試驗，或分別重複操作PCR 同一個檢體在第二個實驗室有再現性;PCR操作流程中，每一批檢體應包含適當的陰性及陽性對照 操作萃取核酸時??入一個陰性對照，另於操作PCR時加入一個水樣對照 操作萃取核酸流程及PCR時各加入一個陽性對照 抑制性對照( inhibition control)：在病人檢體加入弱陽性對照組以偵測是否有抑制PCR反應之物質存在 操作具SARS的PCR實驗室必須採取嚴格的條件來確認陽性結果 SARS的PCR試劑組已製成商品，包括內部對照組( internal controls)、PCR引子及流程已經發表在期刊上，各實驗室均可採行 ;SARS的PCR試驗，其靈敏度係視檢體種類及其在病程中取得的時機而定，真正的SARS病例可能會在PCR檢測中呈陰性(偽陰性結果) Positive control: CDC提供病毒培養陽性之SARS病毒之病毒液 Negative control:水樣之檢體 進行SARS檢驗應在的P3或P4設備的實驗室進行 ; 生物安全防護實驗室 第一、二級：因應有中、低危險致病原微生物 第三級：因應如漢他、SARS等高傳染、致病性病毒 穿隔離衣、戴帽、防護鞋、獨立空調、 負壓的密閉空間，外有兩道隔離門 第四級: 高傳染、致命傳染病，如伊波拉病毒 或生物化學戰。負壓、獨立空間、 穿著太空衣，攜帶氧氣瓶; 第一級(level 1, P1) 指在一般操作情況下不具危險性或危險性極低 之生物，如大腸桿菌-12、腺病毒有關的病毒1至4型 (1)可以在公共區域內，但門須維持關閉。 (2)可在開放的桌上操作。 (3)實驗桌須是可清潔的表面。 (4)窗戶須有紗窗隔離外界昆蟲。 (5)須有可洗眼睛與洗手之設備。 (6)便衣與實驗衣不可放置一起。 (7)定期使用消毒劑清潔。 ;; 第三級(level 3, P3) ?在人類可以引起嚴重或致死的疾病，可能有預防及治療之方法 除了level 1與level 2之規定外，須加入： (1)遠離一般工作區，須控制人員進出。 (2)須在換衣及沖洗區域。 (3)須有負壓區。 (4)空氣進入或出來須有空氣過濾。 (5)窗戶須是不可打破的且封閉的。 (6)在出口處須有不必用手即可打開的洗手槽。 (7)操作人員須訓練如何操作、處理廢物及緊急處理過程，各步驟須貼在可見之處。 (8)實驗衣前方須是封閉性的，且須在送洗前先滅菌。 (9)須有醫學監視系統。 ; ;SARS病毒的全基因組定序 ;台灣的疫情;;;;Molecular epidemiology of SCoV in Taiwan 全基因體定序 11株;;Nested RT-PCR的方法 首先利用long-PCR的方法將SARS基因組分成 T1組擴增下來8組產物 T2組擴增下來7組產物 接著使用T1組與T2組的nested primer來分別擴增TI、T2的PCR products 將這15組擴增下來的products做定序分析 將這些重疊序列組裝起來就是SARS的全基因序列 ;;; 鳥;;Sequencing errors, PCR artifacts, mutable sites in the genome;;HPC 果子狸 HB 獾 B 海狸 DC 家貓 CH 野兔 CM 羌 CFB 貂 RD 浣熊;;;新興病毒的檢測方法學 病毒培養及Random RT-PCR的方法 要用何種cell line養出病毒，養不出病毒顆粒，一切都是空 Ksiazek et. al.、Drasten