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槐定碱抗骨癌痛的作用及其机制的研究 　　[摘要] 目的：采用W256癌细胞诱导的骨癌痛模型大鼠探讨槐定碱抗癌痛药效及其作用机制。方法：采用骨髓腔注射W256癌细胞复制骨癌痛大鼠模型；造模10 d后选取模型复制成功的大鼠36只随机分为模型对照组及槐定碱治疗组，另取同期10只大鼠作为正常对照组；治疗组大鼠于造模第15天开始给予槐定碱25 mg?kg-1治疗10 d；各组大鼠给药前、后测量机械痛阈和热痛阈，末次给药后， 对大鼠患肢进行放射学和组织病理学观察，并采用免疫组化法检测大鼠患肢肿瘤组织环氧酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果：槐定碱可明显提高骨癌痛大鼠机械痛阈和热痛阈值（P0.05，P0.01）；改善肿瘤引起的骨损伤（P0.05），明显下调肿瘤组织COX-2，VEGF表达（P0.05）。结论：槐定碱对W256癌细胞诱导的骨癌痛大鼠有镇痛作用和抑制肿瘤发展作用，其机制可能与下调COX-2，VEGF的表达有关。 　　[关键词]槐定碱；W256癌细胞；骨癌痛；COX-2；VEGF 　　槐定碱是从豆科槐属植物苦豆子中提取分离的单体生物碱（C15H24N2O，相对分子质量248.36）。研究表明，槐定碱是一种高效低毒的抗癌生物碱，具有抗肿瘤、镇痛、抗炎等多种药理活性[1-3]。已开发的制剂“盐酸槐定碱注射液”目前在临床上仅试用于恶性滋养细胞肿瘤的治疗，尚有较多的适应症有待进一步开发。本研究旨在采用W256癌细胞诱导的骨癌痛模型代替传统的疼痛模型，对槐定碱的抗癌痛作用进行初步药效观察和部分机制探讨，为槐定碱的进一步开发和增加新的临床适应证提供理论和实验依据。 　　1材料 　　1.1药品与细胞株 槐定碱，纯度≥98%（南京景竹生物科技有限公司）；W256癌细胞，由浙江医学科学院提供腹水癌细胞种鼠，经本课题组纯化培养所得。 　　1.2试剂 乙二胺四乙酸二钠（天津市顶福化工总厂）；戊巴比妥钠（上海化学试剂公司）；25%戊二醛（上海化学试剂采购供应站五联化工厂）；二甲苯（上海化学试剂公司）；无菌骨蜡（安徽省第二人民医院提供）；COX-2免疫组化试剂盒（SP浓缩型，北京中山生物技术有限公司）；VEGF免疫组化试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。 　　1.3动物 雌性SD大鼠，清洁级，体重180～200 g，购自浙江中医药大学实验动物中心，合格证号SYXK（浙）2012-0013。 　　1.4仪器 XZC-A型压力测痛仪（山东医学科学院）；XZC-2B型自控温度热板仪（山东省医学科学院）；石蜡切片机 M3500（深圳威斯比生物科技发展有限公司）；高频乳腺摄片机（意大利）； C3040-ADUS型光学显微镜照像系统（日本OLYMPUS公司）。 　　2方法 　　2.1骨癌痛模型复制与鉴定 按照文献所述方法制备W256癌细胞悬液和复制骨癌痛模型[4-5]：取雌性SD大鼠40只，左后肢去毛消毒、麻醉，手术切开胫骨中上端皮肤约0.5～1.0 cm，暴露胫骨，先用7号针头穿刺打孔，再用5 μL微量注射器向骨髓腔注入3 μL约含4×103个W256癌细胞的细胞悬液，骨蜡封住针孔，缝合切口。大鼠术后常规饲养10 d后，戊巴比妥钠麻醉，将患肢置高频乳腺摄片机下摄片观察，选取胫骨上端出现明显缺损灶的大鼠用作实验。 　　2.2分组与给药 选取模型复制成功的36只大鼠，随机分为模型对照组和槐定碱治疗组，每组18只；另取同期10只大鼠以生理盐水代替癌细胞悬液注入骨髓腔作为正常对照组。自术后第15天开始给药。其中，槐定碱治疗组腹腔注射槐定碱水溶液25 mg?kg-1（按体表面积计算，相当于临床推荐最大剂量），对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，各组大鼠每天给药1次，共10 d。 　　2.3痛阈测量 各组大鼠分别于给药前和给药后，参照文献所述方法[5]，采用足趾压痛法和热板法分别测量机械痛阈及热痛阈的变化。机械痛阈测量：将大鼠患肢足掌置于压力测痛仪压力针下，启动电动按钮，以出现嘶叫或缩足为痛反应，此时所需压力值（×10 g）即为该动物的机械痛阈值。热痛阈测量：调节热板仪温度至（52±0.1） ℃，然后将大鼠置于热板上，以大鼠出现添后足时所需时间作为该动物的热痛阈值。上述痛阈测量每只大鼠均需测量2次，且间隔3 min以上，取2次均值作为该动物的痛阈值。 　　2.4放射学观察 各组大鼠于末次给药后，3%戊巴比妥钠麻醉，将患肢置高频乳腺摄片机下摄片，并参照文献所述方法进行骨损伤评分[5]。 　　2.5病理学观察（HE染色） 摄片后脱颈椎处死大鼠，剪下患肢，分离胫骨并修剪，取患骨0.3～0.5 cm，4%中性甲醛固定3 d，10%EDTA（pH 7.0～7.4）脱钙4周，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，HE染色，