从碘化N-正丁基氟哌啶醇对心肌细胞蛋白激酶C转位的干预探讨其心肌保护作用的分子机制-药理学专业论文.docxVIP

摘 要 目前，缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤的发生发展机制尚未完全明确， 现有的干预疗法仍不能有效解决I/R损伤问题。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F2）是我课题组在氟哌啶醇（haloperidol，Hal）结构基础上改造得到的新化合物， 前期研究表明，F2心肌保护作用的机制可能与其拮抗钙超载及抑制早期生长反应基因-1 （early growth response-1，Egr-1）mRNA及蛋白表达相关，作为Egr-1 的上游信号分子蛋白 激酶 C （ protein kinase C ， PKC ），其抑制剂能够下调心肌细胞缺氧复氧 （hypoxia-reoxygenation，H/R）Egr-1 蛋白的高表达。PKC家族是体内广泛存在的一类可使 苏/丝氨酸残基磷酸化的蛋白激酶，参与细胞内多种信号转导通路和机体功能的调控。与心 肌I/R损伤紧密相关的PKC亚型有PKCα、βⅡ、δ和ε，因此，本研究观察了H/R心肌细胞PKC 活性的变化；对参与调控H/R损伤的PKC亚型进行转位的分析；运用PKC特异性抑制剂或 激动剂考察PKC亚型在H/R心肌细胞中的生物学功能；进一步探讨和明确F2心肌保护作用 的分子机制。 方法： 1. 采用新生 SD 大鼠原代培养的心肌细胞，换用高纯度氮气饱和 30 min 的缺氧液，置 于缺氧箱中，37 ℃密闭培养 2 h 后，再用正常培养基按常规培养条件培养 30 min，造成复 氧损伤。 2. 非放射性 PKC 活性检测方法研究 H/R 心肌细胞中 PKC 活性的时效变化； Western-blot 法检测心肌细胞 PKCα、βⅡ、δ 和 ε 蛋白表达及其转位的变化；检测 H/R 心肌 细胞中 Egr-1 蛋白表达水平。 3. 比色法测定细胞培养上清液中肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性、双抗体夹心 光化学测定法检测细胞培养上清液中心肌肌钙蛋白（cardiac troponin I，cTnI）的浓度，以 反映心肌细胞损伤的程度；酶联免疫吸附法（enzyme-linked sandwich immunoassay，ELISA） 测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的含量，以反映心 肌细胞炎症程度；Annexin V-FITC/PI 双染法检测心肌细胞早期凋亡率，以反映 H/R 所致心 肌细胞凋亡程度。 结果： 1. 缺氧过程中，心肌细胞 PKC 活性升高，缺氧 2 h 时 PKC 活性显著增加，延长缺 氧时间，PKC 活性趋于下降；缺氧 2 h 时进行复氧，PKC 活性维持不变，直至复氧 120 min PKC 活性恢复至正常水平。缺氧 2 h 复氧 30 min 时，PKC 各亚型蛋白表达未发生变化， 延长缺氧时间至 4 h，PKCε 蛋白表达明显下降，PKCα、βⅡ和 δ 蛋白表达不变化。心肌 细胞 H/R 可导致 CK、cTnI 浓度升高，TNF-α 分泌增多，早期凋亡细胞增加。 2. 心肌细胞H/R可激活PKC各亚型：PKCα、βⅡ和ε分别由可溶性部分向颗粒性部分转 位；PKCδ则由颗粒性部分向可溶性部分转位。F2可以抑制H/R所致PKCα的转位，而激活 PKCε转位；对PKCβⅡ、δ转位不影响。同时，F2可以激活正常细胞PKCε发生转位；对正 常细胞PKCα、βⅡ和δ不影响；磷脂酶C（phospholipase C，PLC）抑制剂U73122 可拮抗F2对 正常细胞和H/R PKCε激活的作用。 3. cPKC 特异性抑制剂 G?6976，可下调 Egr-1 蛋白高表达，减少 CK、cTnI 泄漏和 TNF-α 的分泌，降低早期凋亡细胞检出率。PKCε 亚型特异性抑制剂 εV1-2，可增加 CK、cTnI 漏 出，加快细胞早期凋亡进程，但对 TNF-α 的分泌和 Egr-1 蛋白高表达没有影响。 4. F2可以明显改善H/R所致心肌细胞的损伤。PKC激动剂thymeleatoxin（TXA）可抑制 F2对Egr-1 蛋白高表达的下调，拮抗F2的心肌保护作用；PKCε特异性抑制剂εV1-2 可拮抗F2 对H/R损伤的改善作用，但对Egr-1 蛋白的高表达没有影响。 结论： 1. 心肌细胞 H/R 可引起 PKC 各亚型活性的变化，但其转位的部位及时间不一致；PKCα 的转位可增加 Egr-1 蛋白表达。 2. 心肌细胞 H/R 过程中 PKC 各亚型活性的变化与 H/R 所致损伤有关，其中 PKCα 转 位可加重细胞损伤与凋亡，而 PKCε 转位则减轻上述损伤。 3. F2抑制钙依赖PKCα转位和激活非钙依赖PKCε