传染性法氏囊病病毒上海超强毒株的分子特征及分子免疫研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

传染性法氏囊病病毒 上海超强毒株的分子特征及分子免疫研究 摘 要 传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性 法氏囊病病毒Infectious bursal disease virus,IBDV引起的鸡 的一种呈现世界性流行的烈性传染病,病毒主要侵染和破坏机体的免 疫器官 引起严重的免疫抑制 成为危害养鸡业的主要疫病之一 近 年来 由于 出现 传染性法氏囊病病毒 超强毒株very virulent Infectious Bursal Disease Virus, vvIBDV,使得该病的发生和流 行出现了新的特点,加重了对养鸡业的危害 国外在 80 年代末分离到 超强毒 在 90 年代初 国内也证明有 vvIBDV 存在 由于超强毒株的 出现 传统疫苗不能提供足够保护 预防和控制 IBD 成为一个新的难 题 国内外对 IBDV 的分子生物学已进行了一定的研究 并把研究重 点放在宿主主要保护性抗原蛋白基因 病毒结构蛋白 VP2 基因上 但对 IBDV 超强毒株的研究 国内外开展得都相对较少 IBDV 超强毒 株的毒力标记至今尚不完全清楚 IBDV 超强毒株的起源至今也是个 谜 而对 IBDV 超强毒的预防和控制更是鲜见 本文通过对上海近郊某鸡场数群 10 日龄左右病鸡进行过免疫 接种的临床症状 病理变化分析具 IBD 典型的临床症状和特征性 病变 发病率达 70% 死亡率达 40%病毒分离 纯化 动物回归 血清学检测及病毒核酸分离 纯化 表明病原为 IBDV 进一步对该毒 株 VP2 基因进行扩增 克隆与测序 通过对高变区基因的分析 比较 发现该毒株具有大多数超强毒株所具有的分子特征 在关键位点上与 非超强毒株存在明显差异 在第 1 个亲水区上即 222 位的氨基酸残基 由弱毒株的 P 突变为 A 在第 294 和 299 位氨基酸残基分别由 L 和 N 突变为 I 和 S,在超强毒株 这 3 个氨基酸通常导致毒株的亲和性发生 变化,从而导致毒力大大增强 进一步研究发现,该毒株七肽区的氨基 酸是保守的 为 SWSASGS,而非弱毒株的 SWSARGT 且 279 位和 284 位 氨基酸分别是 D 和 A 七肽区的保守性以及 279D 和 284A 两个特征性 氨基酸是强毒株的两个重要标志 此外 256 位为 I 而非弱毒株的 V 等 这些特征从分子水平上说明 IBDV 上海分离株具备传染性法氏囊 病病毒超强毒 (vvIBDV)的分子特征 确认上海地区以发病日龄早 发病率 死亡率高为特征的鸡传染病由传染性法氏囊病病毒超强毒株 所致 该毒株命名为 SH95 抽提获得高纯度的病毒 dsRNA 是成功进行 RT-PCR 和 cDNA 合成的 关键 本文对 vvIBDV dsRNA 的纯化方法进行了研究 用分离 纯化 的 IBDV 上海超强毒株攻击 4 周龄的非免疫鸡 用超速离心法从感染 鸡的法氏囊中分离 纯化 IBDV 分别应用蛋白酶 K 消化和 Trizol(异 硫氰酸胍-酚-氯仿法)处理两种方法从纯化的 IBDV 中抽提 dsRNA 通 过低熔点琼脂糖凝胶电泳 割胶 酚-氯仿抽提获得纯化的 dsRNA 研 究发现应用蛋白酶 K 消化获得的纯化 RNA 产量高 应用蛋白酶 K 消化 法和 Trizol 处理法提纯的病毒 dsRNA 分别进行 RT-PCR 发现应用前 者能获得 IBDV 全长基因组 而应用后者虽经多次试验分别应用随 机引物和特异引物均未能扩增获得 IBDV 的全长基因组 只反转录 出 VP2 高变区基因 这一现象提示应用前者能获得完整的 dsRNA 而 应用后者可能获得断裂的 RNA 较多 这可能与蛋白酶 K 能破坏样品内 的内源性 RNase 有关 另外 研究发现 对于蛋白酶 K 消化法提纯的 RNA 应用随机引物法反转录合成 cDNA 的效率更高 为了研究传染性法氏囊病病毒IBDV上海超强毒株的全部核苷 酸序列 在应用蛋白酶 K 消化法获得高纯度的 dsRNA 后, 应用随机引 物合成了 cDNA 的第一链 参照基因库中相关 IBDV 毒株的基因序列 设计合成了 3 对引物 应用 long and accurate PCRLA-PCR技术 一步扩增出 IBDV 上海超强毒株全长基因组 cDNA 的 A 片段 B 片段和 VP2-4-3 基因 分别将 VP2-4-3 基因和 B 片段克隆入 pGEM-T 载体并测 序(序列已提交 Genebank,登录号分别为 AY134874 和 AY134875) 序 列分析显示 IBDV 超强毒株 SH95 A 片段上的 VP2-4-3 基因全长 3040bp与基因库中一些毒株的同源性在