兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性研究..docVIP

兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性研究 】目的：进一步研究兔骨髓间充质干细胞分离 和培养方法及其生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治 疗多种疾病提供实验基础。方法：通过密度梯度离心、贴壁 筛选法分离培养兔MSCs。测定其接种贴壁率，在倒置显微镜 下连续观察细胞的形态变化，利用甲基噻唑基四唑法测定 MSCs生长曲线，并应用流式细胞术测定细胞表面标记物。结 果：MSCs接种12h后贴壁率为95%以上，细胞倍增时间约为 h，平均传代时间约5~7d ;培养的MSCs阳性表迖CD29、CD44、 CD 105，阴性表迗CD34。结论：在适宜的实验条件下，体外 培养的MSCs能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能，可作 为组织工程的种子细胞。 关键词】骨髓间充质干细胞；生物学特性；细胞培 The Biological Characterist ics and Cult ure in Vitro of Rabbit B one Marrowd erived Mesenchymal Stem Cells f Abstract) Object iv eTo further study the is olation and cultivation procedures o f mesenchyma 1 stem cells from rabbit in vitro, an d explore th Eir biologic al propertie s. To build an experimen tai basis on applying MS Csas seed ce 11s to treat many diseas es. Methods MSCs were o btained from tibias by d ensity gradi entcentrifug at ion and we re tested th e rate of ad hesion. The configuratio n was observ ed under pha se-contrast microscope c onsecutively and the cel 1 growth was measured by MTT method. Cell c ycle and surface antigens wer e detected t hrough flow cytometer. R esults The subcultured cells showed active prol iferative ab ility. More than 95% of subceltured MSCs were ad hesive in 12 h. MSCs wer e positive f or CD29, CD4 4,CD105 and negative for CD34. Conclu sion In pres ent culture condion, MSC s showed sta ble and rapi d growth in vitro. The c haracteristi cs make it p ossible to M SCs to be th e seed cells for tissue engineering. 〔Key Words ) M esenchymal s tem cells； B iological characteristics; Cell culture 干细胞是具有自我更新能力，且在适宜微环境下具有多 系分化潜能的原始细胞［1］。近年研究发现，机体内除胚胎 干细胞外还存在具有自我更新和分化能力的成体干细胞。其 中骨髓中的干/粒细胞包括间充质干细胞，造血干细胞及网 状内皮系统。MSCs可在体外扩增并有多向分化潜能［2-4］， 且取材方便，免疫耐受性、遗传背景稳定及易于转染外源基 因等，因而作为组织工程“种子细胞”有“广泛的应用前景” ［5 -8］。本实验通过对兔M SCs体外培养法及其生物学特性 进行研究，以建立一套稳定、成熟的兔MSCs培养方法，从 而为细胞移植等组织工程提供种子细胞来源提供实验基础。 1材料及方法 主要试剂与仪器 低糖DMEM培养基、10%胎牛血清、%胰蛋白酶、Ficoll 琳巴细胞分离液、CD29、CD34、CD44、CD105单克隆抗体和 FITC标记的二抗、MTT、倒置相差显微镜、细胞培养箱、流 式细胞仪及超净工作台等。 实验动物 普通级健康新西兰大耳白兔，雌性，兔龄约3个月。 方法 骨髓MSCs的分离纯化与培养兔仰卧固定于兔台上，予 2%利多卡因局麻后，持16号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入 骨髓腔，