甜瓜蔓枯病菌子实体法分离及A型菌株产孢条件的研究.docVIP

甜瓜蔓枯病菌子实体法分离及A型菌株产孢条件的研究 　　摘　要：为解决甜瓜蔓枯病菌(Didymalla bryoniae)组织分离法中枯萎病菌污染和单孢分离法操作复杂的问题，采用挑取单个子实体分离纯化获得甜瓜蔓枯病菌A型菌株。该菌株在12h荧光/12h黑暗的常规光照条件下，不能形成分生孢子器。但经过一定时间的暗处理和间歇紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗)照射后则能够产生大量分生孢子。研究了光照、温度、pH值、培养基、碳源、氮源对产孢量的影响。综合各种因素，A型菌株产生分生孢子的最佳条件为：7d暗培养和4d间歇紫外灯处理的光照条件下，只含有磷酸二氢氨的马铃薯平板培养基，25℃时产生的分生孢子量最多。 　　关键词：甜瓜；蔓枯病菌；分离；产孢 　　中图分类号：S652　文献标识码：A　文章编号：1009－9980(2007)01－84－05 　　 　　瓜类蔓枯病菌Mycospharella melonis(国际上现多报道为Didymella bryoniae)危害多种葫芦科作物，如甜瓜、西瓜、南瓜、黄瓜、哈密瓜等。在新疆、甘肃、上海、浙江等省市区的哈密瓜和西甜瓜产区，蔓枯病大田发病率普遍在20％～30％。在连作地和温室中高达80％。造成的损失甚大。 　　在发病严重的地块中，蔓枯病菌常与枯萎病菌(Fusarium oxysporum)伴生。使用茎部组织法分离时，常会得到两菌杂生的菌落，而且通常是枯萎病菌占优势；陈熙等曾采用单孢分离法分离纯化蔓枯病菌，但操作复杂，耗时长。 　　不同类型菌株产生子实体和孢子的能力差异很大，Chiu等根据培养性状将蔓枯病菌分为A、As、B－a、B－1a、B－b5个类型，其中只有A型菌株不能在常规条件下产生孢子器和孢子，其他4种类型的菌株均可在不同的生长阶段产生孢子。 　　我们从南京和新疆的感病甜瓜上分离的蔓枯病菌株，在PDA上培养时，菌落背面初白色，后期变为黑色，基生菌丝深褐色，有同心轮纹；气生菌丝发达。絮状、中间稠密，略隆起，初白色，老化后灰白色，不形成子囊座和分生孢子器，这与Chiu等和贾菊生间描述的A型菌株极其相似。 　　为了解决甜瓜蔓枯病菌分离过程中的枯萎病菌混杂和大规模接种鉴定所需的孢子问题，我们以感染蔓枯病菌的甜瓜茎蔓为试材，对甜瓜蔓枯病菌的分离方法和A型菌株的产孢条件进行了系统研究，首次使用子实体法分离得到了甜瓜蔓枯病菌纯化菌落，快速诱导产生了大量分生孢子，在甜瓜、黄瓜上回接时致病性强，为蔓枯病接种鉴定、抗病育种以及综合防治奠定了基础。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　2005年春从江苏农业科学院试验地、南京玄武区麒麟镇试验地和新疆农业科学院试验地发病严重的地块中采集症状典型的甜瓜蔓枯病蔓。 　　 　　1．2　分离方法 　　1．2．1　子实体法 选用子实体突出表皮的1～2cm蔓枯病蔓，自来水冲洗2～3min，75％酒精表面消毒30s，无菌水清洗2～3min，然后用灭菌的解剖针挑取单个子实体，置于盛有无菌水的灭菌培养皿中浸泡2min。 　　1．2．2　组织分离法 选取甜瓜蔓枯病病蔓的病健交界处，75％酒精表面消毒30s，切取4～5mm2的小块，5％次氯酸钠表面消毒1、3、5、7min，无菌水冲洗2～3次。 　　将子实体或组织块接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上，培养基添加浓度均为5mg/mL的利福平和氨苄青霉素各1mL/L，每个培养皿接种5个点，每批病样接种10皿。以上操作均在超净台上进行。接种后的培养基在25℃，12h荧光/12h黑暗的条件下培养。4～5d后观察有无污染。 　　 　　1．3　不同因子对病菌产孢量的影响 　　1．3．1　光照条件对病菌产孢量的影响 用解剖针挑取菌丝接种于PDA培养基平板的中央，暗培养0、1、3、5、7、9d后，分别在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗)下30cm照射0、2、4、6、8 d，共计30个处理，另设12h光照/12h黑暗、24 h光照，处理2～3周为对照。25℃下培养，将整个菌落用50mL无菌水配成悬浮液后用血球计数板测产孢量。实验中所使用的培养皿直径为15cm，每处理设3次重复，下同。 　　1．3．2 温度对病菌产孢量的影响 所用培养基为PDA，接种后分别于0、5、10、15、20、25、30、35、40℃共9个温度处理于7d黑暗+4d紫外灯(12h紫外灯/12 h黑暗)照射的条件下培养。 　　1．3．3　不同pH值对病菌产孢量的影响 所用培养基为PDA，用已灭菌的0.5mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的NaOH溶液调节灭菌后的马铃薯葡萄糖培养基的pH值，METTLER TOLEDO 320-S型pH计标定为3、4、5、6、7、8、9、10、11共9种不同的酸碱度，配制