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关于“基因工程” 操作步骤的深入探讨 杭州市艮山中学 朱靖 两种酶也要有选择性，避免用同裂酶和同尾酶 * * 三、受体细胞的筛选 二、构建重组质粒时限制酶的选择 一、获取目的基因的方法 一、获取目的基因的方法 目的基因的序列已知： 用化学方法合成，或者用PCR扩增； 目的基因的序列未知： 建立基因文库，从基因文库中找到。 “基因文库相当于图书馆，目的基因就是图书。” 基因文库的构建 某生物体内全部DNA 限制酶 某生物体内全部DNA 限制酶 1.从基因文库中获取目的基因的一般过程： （1）依据已知的目的基因序列设计引物 （2）利用PCR技术从基因文库中扩增出目的基因 （3）进行凝胶电泳分离得到目的基因，并用试剂盒回收。 2.未知完整序列的目的基因获取过程： （5）对目的基因进行测序。 （1）将一个文库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养皿上，取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纤维滤膜吸印。 （2）制备有同位素标记的探针进行分子杂交。 （3）进行放射自显影后在培养皿上找出含有目的基因的菌落或噬菌斑。 （4）培养后，用反向PCR扩增出未知序列。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 DNA连接酶 反向PCR 3.序列完全未知的目的基因获取过程： （1）从其相近的物种中寻找出已经测序的该基因的相似基因，通过电脑软件比对出该基因可能存在的保守区域。 （2）