基于发光金纳米粒子荧光增强法测定溶菌酶..docVIP

基于发光金纳米粒子荧光增强法测定溶 参照文献方法合成了 BSA修饰的水溶性发光金纳米 粒子，并考察了其与溶菌酶之间的相互作用。依据溶菌酶对 金纳米粒子的发光增强现象，建立了测定溶菌酶的荧光新方 法。考察了发光金纳米粒子的浓度、pH值、反应时间及共存 物质对测定的影响。优化条件为：发光金纳米粒子浓度XI0 一6 mol/L、 pH 、反应时间lOmin。在此条件下， 荧光增强与溶菌酶浓度在2X107 荧光增强与溶菌酶浓度在2X10 7 ?8X10 -6 -8mol/L。 -8 mol/L。对 X10 一6 mol/L溶菌酶平行测定6次， mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为X 10 相对标准偏差为％。本方法具有灵敏度高、探针水溶性好和 生物毒性低的优点，同时，常见低等电点蛋白质对分析不干 扰。本方法用于合成样品及鸡蛋清中溶菌酶含量测定，平均 回收率为％?％。 关键词溶菌酶；发光金纳米粒子；荧光方法 1引百 1引百 溶菌酶是一种高等电点的酶 ，广泛存在于身体 组织以及分泌物中。鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的体液及 微生物中也含有此酶，其中蛋清中含量最丰富。溶菌酶具有 天然、易消化、易吸收、无毒性等优点，并具有溶解一些细 替代一些化学合成药物，用于食品防腐 \ 。此外，研 究表明，尿液和血清中溶菌酶的增加会导致白血病 肾脏疾病和脑膜炎等。因此，溶菌酶已被广 肾脏疾病 和脑膜炎 等。因此，溶菌酶已被广 泛应用于生物工程和医疗领域。目前，有关溶菌酶的分析方 法主要有动态浊度法和溶板法灵敏测定溶菌酶的荧光方法也有报道。近年来，高 ，由于溶菌酶本身不具有荧光，一些外源探针，主要是CdSe 法主要有动态浊度法 和溶板法 灵敏测定溶菌酶的荧光方法也有报道 。近年来，高 ，由于溶菌酶本 身不具有荧光，一些外源探针，主要是CdSe 2 /CdS 和CdSe以及CdHgTe等发光量子点 被广泛采用 近年来，纳米尺寸的贵金属粒子由于其独特的发光性能 备受关注与上述发光量子点相比，直径小于 备受关注 与上述发光量子点相比，直径小于5nm的 发光金纳米粒子具有制备简单、生物相容性好等优点，尤其 是低毒性探针可能更适合分析一些含生物酶的系统。目前， 利用各种方法制备的GNPs已被用于溶液中Hg 2 + \和犯 2+ \的测定，以及细胞成像分析 \ 。本研究将GNPs应用于TX-100及其临界胶束浓度的 测定 \ 。 本研究参照文献\合成了牛血清蛋白修饰的GNPs，并考 察了它们与溶菌酶及其它常见蛋白质的相互作用。结果表明 随着溶菌酶加入浓度的增加，GNPs的荧光明显增强，而其它 低等电点的蛋白质对GNPs的荧光影响很小，据此建立测定 溶菌酶的荧光方法，并用于鸡蛋清样品和含蛋白质合成样品 中溶菌酶含量的测定，结果令人满意。 2实验部分 仪器与试剂 F-4500荧光分光光度计、U-3010紫外-可见分光光度 计；JEOL-XX高分辨电镜；TGL-16C型高速离心机;pH酸度 计;85-1型磁力搅拌器。牛血清白蛋白；HAuCl 4 4H 2 0;溶菌酶。mol/L磷酸盐缓冲液；其它试剂均为分 析纯。水为二次蒸榴水。 实验方法 GNPs 的制备 \ 将 mLl%HAuCl 4 4H 2 0稀释至20mL，加入13 4mgBSA，剧烈搅拌2h，加入mg NaBH 4 ，继续反应24h，高速离心除去颗粒较大的粒子， 保留淡黄色的溶液。 样品处理与检测在一系列1 OmL具塞试管中分别加入 mLGNPs溶液，mL mol/L PBS缓冲液，然后加入不同量 的标准试剂溶液或样品溶液，稀释到5mL,常温下放置10m in 后进行荧光测定。测定在室温下进行，采用10mm石英液池， 激发波长为3 20nm，激发和发射狭缝宽度为10nm，光电倍增 管的负高压为700V。 实验用鸡蛋样品购于芜湖当地市场，将蛋清与蛋黄分开， 用PBS缓冲液将蛋清稀释10倍。取适量上述样品至GNPs溶 液中，反应lOmin后进行荧光测定。 3结果与讨论 发光金纳米粒子的表征 由GNPs的透射电镜图可见，合成的GNPs约nm，较均一 每个发光金纳米粒子约包含100个小的金纳米粒子 \ 1发光金纳米粒子的透射电镱 Fig. ITEMimageofluminescentgoldn anoparticles 合成出的金纳米粒子的荧光光谱见图2。在32 0nm紫外 光激发时，在410nm处有一半峰宽大约为70nm的荧光发射 10 带和6 1导带之间 10 带和6 1导带之间 2还表明，在290nm处有个很 尖锐的紫外吸收峰，与文献\一致。以硫酸奎宁为标准，测 得此发光金纳米粒子的荧光量子产率为，证明制备的发光金 纳米粒子具有较高的荧光量子产率 \ 。 发光金纳米与溶菌酶之间的作用 溶菌酶是高等电点的蛋白