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茶树等木本植物炭疽菌种群遗传分化的研究 　　摘要：从福建省不同地区茶树及其他木本植物上分离获得38株炭疽病菌，采用rDNA-ITS序列分析方法对供试菌株进行系统发育分析和种群分化研究。结果表明，炭疽菌不同种群遗传多样性丰富且存在遗传差异，供试不同寄主来源炭疽病病菌在rDNA-ITS基因序列上存在一定的特异性，但不明显。供试炭疽病病菌存在一定的寄主专化性，不具有地理来源特异性。序列比较结果显示，菌株间的ITS序列同源性较高，但仍存在多种不同类型的碱基变异，包括碱基的缺失、突变、插入等。 　　关键词：茶树；木本植物；炭疽病菌；遗传多样性；ITS序列分析 　　中图分类号： S435.711文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）11-0042-03[HS）][HT9.SS] 　　炭疽病是刺盘孢属真菌（Colletotrichum Corda）侵染植物引起的病害，种类繁多，寄主范围广泛，有记录的寄主植物种类至少有176属190种，包括果树、林木、蔬菜、牧草、花卉等[1]，且不同种类的炭疽菌生物学、生理学特性多存在差异。炭疽病病菌侵染茶树，引起茶树感染炭疽病，该病的发生可影响茶树的生长，降低茶叶的产量与品质[2]。炭疽病病菌种间、种内存在较多变异，甚至不同寄主之间也会存在一定的遗传多样性，这些遗传变化影响炭疽病病菌的侵染特性、寄主选择性、致病力、生物学特性，及对茶树炭疽病的防治效果。为深入了解炭疽病病菌的遗传多样性特征，rDNA-ITS序列分析、限制性片段长度多态性分析等多种分子标记技术已得到广泛应用[3-4]。 　　绝大多数真菌rDNA-ITS区域基因序列具有广泛的多态性，多数表现为种内基因序列相对一致，而种间差异明显的特点[5]。鉴于rDNA-ITS序列片段长度小且易于分析的特点，可以从其序列差异中得到足够的信息用于种内系统发育分析，现在已被广泛应用在真菌性病害的分类鉴定和病害诊断中[6-8]。本研究通过分析从福建省不同地区寄主为茶树或其他木本植物上分离获得的炭疽菌rDNA-ITS区域序列异同，探讨福建省不同寄主来源炭疽病病菌以及不同地区茶树炭疽菌的遗传多样性，将对今后炭疽病的防治工作提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1供试菌株[HT] 　　从福建省茶树上采集炭疽病病菌标本，经单孢分离获得25株病原菌菌株，寄主为非茶树木本植物的13株炭疽病菌菌株由福建农林大学植物保护学院提供，组成供试38株不同采集地区、不同寄主植物的炭疽病病菌标本，菌株编号、种名、寄主植物、拉丁学名、采集地、GenBank登录号等信息如表1所示。38株菌株均用马铃薯蔗糖琼脂（PSA）平板培养基保存于4～8 ℃冰箱中备用。 　　用真菌rDNA-ITS通用引物[JP3]ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[JP]对供试38株菌株进行PCR扩增[9]。试验PCR反应的体系及其组成成分：5 ng模板DNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物、5 μL PCR缓冲液、0.5 μL DNA聚合酶、4 μL dNTPs。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 52 s、56 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s，共循环30次；71.5 ℃延伸11 min。扩增反应结束后，用微量移液器吸取4 μL扩增产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳法检测其含量，切取电泳条带经纯化后送上海华大基因科技有限公司进行测序。 　　1.2茶树等炭疽菌遗传多样性分析 　　将供试38株炭疽病菌菌株的ITS基因序列用MEGA 6.0软件的邻结法（Neighbor-Joining，简称NJ）构建菌株的系统发育树，以自展法对其进行检测，循环1 000次。采用软件DNAMAN 6.0计算各菌株变异位点和碱基含量，并选用Kimura 2-parameter计算菌株间的遗传距离。对供试的38株植物炭疽病病菌rDNA-ITS基因序列进行遗传多样性检测分析，比较茶树炭疽菌与其他木本植物炭疽菌的序列差异。 　　2结果分析 　　2.1rDNA-ITS区PCR扩增结果 　　利用通用引物ITS1、ITS4对38株供试炭疽菌菌株的 rDNA-ITS 区域扩增，均能扩增获得1条特异性条带，序列大小约为580 bp。扩增的部分结果如图1所示。 　　2.2遗传多样性分析 　　由图2可知，在遗传距离约为0.02处，38株炭疽病病菌菌株的进化树可分为3个类群，分别是Q1、Q2、Q3，其自检支持率分别为98%、99%、99%；其中Q1群中包含的菌株最多，[FL）] 　　共26株，超过菌株总数的68%，其中有19个茶树炭疽菌，7个其他木本植物炭疽菌。把Q1群可以再分为3个小群，分别为F1、F2、