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肿节风片微生物限度检查的方法验证 　　摘要: 目的:通过微生物限度检查方法验证,建立肿节风片的微生物限度检查方法。方法 :采用5种阳性对照菌回收率试验验证本品是否具有抑菌作用。结果:细菌计数采用低速离 心 +培养基稀释法(0.2ml)、霉菌和酵母菌计数采用常规法,稀释剂对照组和试验组各试验 菌的 回收率均高于70%;控制菌采用常规法进行检查,阳性对照菌检出,阴性对照菌未检出。结 论:建立的肿节风片微生物限度检查方法符合《中国药典》2005年版规定,方法可行。 　　关键词:肿节风片;微生物限度;方法验证 　　中图分类号: R446.5 文献标识码: B 文章编号: 1008-2409(2009)06-1077-03 　　 　　肿节风片功效清热解毒,消肿散结,用于肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎属热毒壅盛证侯者,并 可用于癌症辅助治疗。根据其用药途径和制法,本品微生物限度检查应进行细菌数、霉菌和 酵母菌数测定及大肠埃希菌检查。按照《中国药典》2005年版微生物限度检查法[1]规定,方法必须经过验证。 　　 　　1 仪器与试药 　　 　　1.1 样品 　　肿节风片3批(广西河丰药业有限责任公司,批号:050906、051001、060302)。 　　1.2 菌种 　　大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CM CC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。以上菌种 均由广西壮族自治区食品药品检验所提供。 　　1.3 培养基 　　营养琼脂培养基(050413)、玫瑰红钠琼脂培养基(050113)(广西壮族自治区食品药品检 验所);胆盐乳糖培养基(BL)(050517)、 改良马丁培养基(050526)、改良马丁琼脂 培养基(050621)(北京陆桥技术有限责任公司); pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(2 0050412)(北京奥博星生物技术有限责任公司)。 　　1.4 仪器 　　JJ200电子天平;YXQ-LS-50A全自动立式压力蒸汽灭菌器; GD65-1鼓风干燥箱;TDL-60 C 低速台式离心机;GHP400隔水式恒温培养箱;LRH-250-MS霉菌培养箱;灭菌刻度吸管等。 　　 　　2 方法与结果 　　 　　2.1 菌液制备 　　取经37℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物和经2 5℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁培养基培养物,分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～100cfu的菌悬液,备用。另取经25℃培养7d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养 物,加入5ml 0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱,吸出孢子悬液,用0.9%无菌氯化钠溶液制 成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液,备用。 　　2.2 供试液的制备 　　称取样品10g,置灭菌研钵中,研细,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液转移并稀释至 100ml,摇匀,作为1∶10的供试液。 　　2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法的建立及验证 　　2.3.1 回收率试验 首先选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌作为试验菌株,按常规法进行预试验 ,计算回收率。 　　试验组:取1∶10供试液1ml和50～100cfu试验菌,分别注入同一平皿中,立即倾注营养琼脂 培养 基。每株试验菌平行制备2个平皿,待凝固后,置规定温度,细菌培养24～48h,白色念珠菌 和黑曲霉培养48～72h,按平皿法测定其菌数。 　　菌液组:取试验菌50～100cfu注入平皿中,立即倾注琼脂培养基。每株试验菌平行制备 3个 平皿,待凝固后,置规定温度,细菌培养24～48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h,测定 所加入的试验菌数。 　　供试品对照组:取1∶10供试液1ml注入平皿中,立即倾注营养琼脂培养基。待凝固后,置规 定温 度,细菌培养24～48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h,按菌落计数方法测定供试品本底 菌数。 　　稀释剂对照组:取稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml和50～100cfu试验菌,分别 注 入同一平皿中。按平皿法测定其菌数,考察稀释剂对试验有无干扰。该对照组各试验菌的回 收率应不低于70%。 　　结果试验组金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均为0%,低于70%,表明肿节风 片对细菌有抑制作用;白色念珠菌回收率为95%,高于70%,表明肿节风片对真菌无抑制作用 ;稀释剂对照组3种试验菌回收率均高于70%,表明pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无抑菌 作用,对实验无干扰。 　　根据常规法预试验结果选用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌作为试