高效液相色谱电感耦合等离子体质谱的研究Medaka体内水溶性汞结合蛋白.docVIP

高效液相色谱电感耦合等离子体质谱的研究Medaka体内水溶性汞结合蛋白 　　摘 要 采用高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术，对不同形态汞暴露后的Medaka肝脏和脑组织中水溶性蛋白进行研究，以体积排阻柱为液相分离柱，流动相为0.15 mol/L NH??4Ac，流速为0.5 mL/ min。利用电感耦合等离子体质谱对Medaka肝脏和脑组织提取液中铜、锌和汞的含量进行了分析，检出限为0.01～0??05 　　??SymbolmA@ g/L，元素的加标回收率为93.1%～97.0%。通过与空白组对比发现，汞暴露后的Medaka鱼体肝脏和脑组织对水体中的汞有一定程度的富集；不同形态汞暴露后，在Medaka肝脏和脑组织中的分布明显不同，并且都会在一定程度上降低Medaka肝脏和脑组织中铜与锌的含量，有利于进一步研究汞在生物体内的毒性机理。 　　关键词 高效液相色谱； 电感耦合等离子体质谱； 汞结合蛋白?? 　　 　　1 引 言?? 　　汞因其特殊的物理化学性质，一直被广泛应用。但汞具有较高的生物毒性，如神经毒性和肾脏毒性????\??。自20世纪50年代日本水俣病爆发后，对于汞毒性的研究备受关注，汞污染已经成为一个全球性污染问题????\??。汞的主要存在形式是单质汞、无机汞和有机汞。不同形态的汞在环境中和生物体中可以相互转化，并且对生物体的毒性也不相同????\??。环境中的汞污染物被动植物吸收后在生物链中逐渐富集传递进入人体，在被人体肠道吸收后，富集在肝、胃、脑组织等部位，对中枢神经造成危害????\??，严重的可导致死亡。目前，对于汞的研究主要集中在对环境和生物体中总汞的测定????\??，以及小分子的有机汞和无机汞的形态分析????\??，但是汞在生物体内吸收、迁移、转化和代谢的途径以及与生物活性分子结合后对生物活性影响的机理尚不十分清楚。?? 　　随着金属组学概念的提出，人们对于金属的研究重点已经从总量测定和小分子的形态分析，转移到金属与生物大分子的相互作用????\??。在金属结合蛋白的研究中，保证目标蛋白在分离过程中的稳定性十分关键。高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用的技术具有接口简单，高效分离，灵敏度高，前处理简单等特点，被广泛应用于生物样品中金属结合蛋白的分析????\??。 ?? 　　动物暴露实验是外源性有毒化合物毒理学研究的常用手段。鱼是人类食物摄入汞的主要来源，水体中的汞可通过食物链在鱼体高度富集，富集倍数高达数十万倍????\??。本研究选用鱼类模型作为研究汞化合物毒性机制的简单有效的实验动物。日本Medaka （??Oryzias latipes??）自20世纪80年代被国际标准化组织列为毒性实验受试种之一，其具有体形小、饲养方便、繁殖周期短、繁殖能力强、对化学毒物敏感等优点,可很好地应用于多种环境污染物的毒理学实验中，已作为一种国际通用的鱼类模型被广泛使用????\??。?? 　　本实验用不同形态的汞对Medaka进行暴露，利用HPLC-ICP-MS联用技术对甲基汞和无机汞暴露后的Medaka肝脏和脑组织中水溶性汞结合蛋白进行研究，同时还对肝脏和脑组织蛋白提取液中铜、锌和汞的含量进行了测定，有助于进一步研究不同形态汞在生物体中吸收、迁移、累积、生物转化及代谢的机制。 　　2 实验部分?? 　　2.1 仪器与试剂?? 　　1200型高效液相色谱仪，7500ce型电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent公司）。?? 　　HgCl????2??（≥99.5，北京化工厂）; 氯化甲基汞（≥98%，德国Merck公司）; HNO??3（GR，65%。德国Merck公司）； 甲醇（HPLC纯，美国Baker公司）； 乙酸铵（GR，北京化工厂）; Tris （超纯级，美国Solon公司）。除特别指明外，其它试剂均为分析纯。去离子水（18.3 MΩ cm）来自超纯水系统（Barnstead International, Dubuque, IA, USA）。?? 　　取适量HgCl????2??和氯化甲基汞，分别溶于5%（V/V）HNO??3-甲醇混合溶液中，配制成含1000 mg/L Hg的标准储备液，密封于棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存。?? 　　2.2 动物汞染毒实验?? 　　实验用鱼养殖在与实验用水的水质、温度和光照一致的循环流动水系统中，在标准无病害环境下，每天投喂市售丰年虫2次。循环水为自来水经活性炭多层过滤纯化，预先至少曝气24 h以上，其水质参数如下：pH 6.9～7.9；溶解氧浓度为5～7 mg/L；硬度为CaCO??3 200 mg/L；电导率为650 　　??SymbolmA@ S/cm；水温保持在22.5～25.5 ℃范