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鸡传染性贫血病检测的方法的研究进展 　　摘要：鸡传染性贫血病（CIA）是以再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩为主要特征，以侵害雏鸡为主要对象的免疫抑制性疾病。对该病毒的病原学、血清学、分子生物学及诊断方法等进行了综述，以期对该病的研究与防控提供一定的参考。 　　关键词：鸡传染性贫血病（CIA）；免疫抑制；检测方法 　　中图分类号：S831 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）01-0082-03 　　鸡传染性贫血病又称鸡出血性综合征、贫血性皮炎综合征、蓝翅病，是由鸡传染性贫血病病毒（Chicken Infectious Anaemia Virus， CIAV）引起的以雏鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩为主要特征的免疫抑制性疾病。Yuasa等[1]首次分离到该病毒后，德国、瑞典、英国等国家学者也相继报道发现该病毒。1992 年，李孝欣等[2]首次在我国分离到该病毒，随后通过对国内许多地区鸡群进行CIA血清学调查和病毒分离鉴定，结果表明在我国许多地区普遍存在该病毒，一些鸡场的阳性率高达40%～70%。该病的发病率一般在20%～60%，高时可达100% ，死亡率一般在5%～10% ，严重时可达60% 以上。该病主要导致雏鸡再生障碍性贫血和免疫抑制，使鸡群对其他病原的易感性增高和对某些疫苗的免疫应答能力下降，从而容易发生继发感染和疫苗的免疫失败，给养殖业造成巨大经济损失。 　　1 病原学方法 　　1.1 病血液学检查 　　采集病鸡的血液，加入柠檬酸钠抗凝剂，取1 mL抗凝血加入红细胞压积管中，以3000 r/min 离心30 min 。红细胞压积值低于27% 且骨髓黄染的判为鸡传染性贫血病阳性。 　　1.2 电镜观察 　　CIAV 病毒粒子小，并且无论是感染易感动物还是接种于敏感细胞，获得的病毒效价都比较低，因此直接进行电镜观察很难见到病毒粒子。直接电镜观察主要用于粪便、组织培养物中病毒的定性和新分离毒株的鉴定，也可通过纯化细胞培养液中的病毒粒子，再经过负染后进行电镜观察，病毒粒子呈球状，直径为23～25 nm ，二十面体对称。免疫电镜（IEM）观察比直接电镜观察的敏感性更高，病毒是免疫复合物的聚集状态，镜下更容易找到病毒粒子[3-8]。 　　1.3 病毒分离鉴定 　　病毒分离培养是CIAV鉴定中最常用的方法之一，一般取感染7d的鸡组织进行分离。CIAV在鸡胚成纤维细胞、鸡肾细胞、鸡胚肝细胞等细胞上均不生长，但在马立克氏病肿瘤细胞系MDCC-MSB1、MDCC-JP2、MDCC-RP1细胞上生长良好，目前普遍使用MDCC-MSB1传代细胞做体外培养。其次，也可CIAV在鸡的白血病病毒B淋巴细胞LSCC-1104/X5 B1、禽成骨髓细胞增生病病毒转化的细胞系LSCC-HDII上增殖。但是一般需要6～8代培养才会出现细胞病变[7] 　　2 血清学方法 　　2.1 病毒中和试验（VN） 　　NV试验既可用SPF鸡，又可用培养细胞进行，以SPF鸡作中和试验时，将血清5倍稀释后在56℃灭活30min，与等体积2×103TCID50/mL的CAV混合后37℃作用1 h，接种5只1日龄SPF鸡，每只0.1 mL，14 d后确定其感染性，3只及以上鸡发病，则判为中和抗体阳性，1～2只鸡发病判为疑似。 　　以培养细胞作中和试验时，感染细胞以1∶5 继代，需经过7次继代，根据继代细胞是否死亡做出判定，血清抗体中和效价以稀释倍数的倒数表示。 　　2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） 　　Kurian等[9]建立了一种检测CIAV血清抗体的重组抗原ELISA 检测法，该法将澳洲株VP1 基因克隆到工程菌表达载体中，表达出的VP1融合蛋白可以成功地用于鸡CIAV抗体的ELISA检测[9]。ELISA是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 　　2.3 间接免疫荧光抗体试验（IFA） 　　MDCC-MSB1细胞培养收获的病毒可作为细胞抗原检测血清[10]。该抗原可与C IAV 阳性血清反应，用荧光标记的抗鸡IgG 显示，荧光显微镜下观察，在肿胀的细胞核区出现较小的、形态不规则的荧光染色颗粒或轮环状结构，可判为抗体阳性。但应设立严格的阳性血清、阴性血清和非CAV感染细胞作对照，以排除非特异性荧光和可能掩盖特异性反应的背景染色。 　　3 分子生物学方法 　　3.1 聚合酶链式反应（PCR） 　　CIAV基因组很小，且各个CIAV毒株的基因组序列很保守。因而设计诊断用的通用性PCR引物是可行的。许多研究者设计了特定的寡核苷酸引物，扩增出CIAV特