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利用ISSR分子标记剖析辣椒种质资源遗传多样性 　　摘要：运用ISSR标记对8种辣椒进行了遗传多样性的研究。用30条ISSR引物进行筛选，有21条可扩增出清晰可辨条带，而这21条引物在8种材料中共扩增出382个条带，其中270个条带（70.6%）表现出多态性；根据Nei和Li等的遗传相似系数（GS）和遗传距离（GD）对8种材料进行分析，结合SPSS 16.0分析软件进行聚类，构建其遗传相关聚类图谱。 　　关键词：辣椒；ISSR；分子标记；遗传多样性 　　中图分类号： S641.303.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0080-03 　　辣椒（Capsicum annuum）别名番椒，于明末清初传入我国，至今已有300多年的栽培历史[1]。我国辣椒种植面积有33万～40万hm2，主要分布为福建的小米椒、四川的朝天椒、江南的羊角椒、河南的樱椒、山东的大红椒等。作为在食品烹饪加工中不可缺少的佐料佳品，其味辛香，性温热，有刺激性，同时兼具很高的营养价值，是人们喜爱的蔬菜和调味品，每年产量和经济效益稳居蔬菜作物之首[2-3]。 　　在真核生物基因组中散步着大量的简单串联重复序列（simple sequence repeat，SSR）[4]。SSR通常为1～4个碱基组成的4～10个或者更多个串联重复单元。简单序列重复区间扩增多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）[5]是在SSR基础上发展起来的一种新的标记技术。其基本原理是在SSR序列的5′或3′端加1～4个锚定碱基，并以此为引物对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。ISSR 是一种快速、可靠的标记技术，具有更好的稳定性和重复性，在植物领域中已经广泛用于重要的农作物如水稻[6]、小麦[7]和棉花[8]等的品系鉴定、遗传作图、基因定位及遗传多样性分析等研究中。当前，ISSR标记亦存在一些缺点，限制了其在某些方面的应用，目前ISSR标记技术主要应用在植物方面，而在动物方面的应用鲜有报道。辣椒以其独特的蔬菜和调味品地位越来越受到人们的关注，本研究采用ISSR分子标记对不同来源的8个辣椒种子的遗传多样性进行了系统分析。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料处理 　　1.1.1 材料 本试验8种辣椒材料及编号见表1。脱氧核苷三磷酸（dNTP，2.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）；PCR引物序列见表2。 　　1.1.2 仪器与设备 PCR扩增仪：Eppendorf AG22331 Hamburg；电泳仪：nYY-12型电脑三恒多用电泳仪；凝胶成像系统：TANON-200。 　　1.1.3 材料处理 8种辣椒种子在实验室培养成幼苗，取其幼苗在-80 ℃的冰箱中冷冻24 h后，取出研磨成粉末后立即装入1.5 mL离心管中。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA提取与检测 使用改良的CTAB法提取辣椒基因组DNA；采用琼脂糖凝胶电泳法检测辣椒DNA的完整性。 　　1.2.2 ISSR-PCR扩增体系 PCR反应在基因扩增仪中进行。PCR反应体系为25 μL，反应体系如表3。PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火（温度由引物决定）30 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 10 min。 　　1.2.3 ISSR产物的检测 扩增产物在3%的琼脂糖凝胶中电泳，然后采用凝胶成像系统拍照保存。 　　1.2.4 数据分析 统计条带的有无，强带和可重复出现的弱带记为有，否则为无。采用Nei和Li等的计算法GS=2Nij/（Ni+Nj）和GD=-lnGS，来计算两两材料间的相似性系数（GS）和相似距离（GD），其中Nij为材料i和j共有的条带数，Ni和Nj分别为材料i和j各自的条带数。利用SPSS 16.0分析软件进行聚类，构建遗传相关聚类图谱。 　　2 结果与分析 　　2.1 辣椒DNA质量和完整性 　　通过改良的CTAB法提取8种辣椒幼苗的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，提取的DNA条带明亮完整，无拖尾现象。说明提取出的DNA中蛋白质和多糖的污染少，提取的基因组DNA质量可以满足ISSR分析的要求。 　　2.2 引物的扩增效果 　　如表4所示，30个ISSR引物对8个辣椒的多态性分析结果表明：除ISSR-01、ISSR-02、ISSR-03、ISSR-23、ISSR-25、ISSR-26、ISSR-27、ISSR-29外，有21个ISSR引物可获得稳定的多态性条带。21个引物共扩增出382个条带（图2），片段大小为250～2 000 bp，各个引物扩增的条带数为1～8个，多态性条带为270个，平均多态率为70