AMH对猪卵泡膜细胞类固醇激素合成酶的影响极其机制-研究.pdfVIP

本项研究受下列基金资助 1. 安徽农业大学“学科骨干培育计划” 2.安徽省自然科学基金（1408085MKL40） 3.安徽省科技攻关项目（1301032157） SUPPORTED BY 1. Foundation for Discipline Key Scholars of Anhui Agricultural University 2. Natural Science Foundation of Anhui Province (1408085MKL40) 3. Key Technologies R D Program of Anhui Province (1301032157) 万方数据 摘要 抗缪勒氏管激素 （anti-müllerian hormone ，AMH ）是转化生长因子β （transforming growth factor ，TGF-β ）超家族成员之一，由生长卵泡中的颗粒细 胞分泌，能够抑制原始卵泡的募集和降低生长卵泡对促卵泡素的敏感性，但其作 用机制尚不清楚。猪是医学试验上理想的动物模型，为了深入探讨AMH在对猪 卵泡膜细胞在类固醇合成上的作用，开展了如下实验： 试验一：AMH在猪上的表达模式 本试验主要采用RT-qPCR技术，分析了AMH及AMHR在猪不同组织器官上 以及在不同卵泡直径上的表达规律；利用ELISA技术，分析了在不同直径卵泡液 中AMH 的表达规律。试验结果表明：AMH及AMHR2在猪睾丸和卵巢中高表达， 而在其它组织中不表达或表达量极低。颗粒细胞中AMH mRNA水平和卵泡中蛋 白水平均呈现随着卵泡直径的增大，AMH 的表达量逐渐降低；在大卵泡（＞5mm ） 颗粒细胞中，AMHR2表达量最高 （P0.05 ），而小卵泡及中卵泡（直径1-5mm ） 的颗粒细胞中AMHR2 的表达量最低，且无明显差异 （P ＞0.05 ）。这说明，AMH 及AMHR2 的表达量与卵泡的生长发育阶段有关。 试验二：猪卵巢卵泡膜细胞的分离纯化和培养 采用三种方法进行了猪卵泡膜细胞的优化，方法A ：注射针头刮去颗粒细胞 层，方法B ：手术剪碎膜细胞层。A和B法均用IV型胶原酶消化后percoll密度梯度 离心获取44%和35% 中间层为膜细胞，C法直接将膜细胞层用IV型胶原酶消化后 采用两次percoll梯度离心获取卵泡膜细胞。利用波形蛋白、角蛋白、因子Ⅷ三种 蛋白的抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定和流式细胞术鉴定细胞纯度。结果表明： 方法A 获得的膜细胞存活率及纯度均显著高于方法B和C （92.00% vs. 80.33%, 85.00% ；95.77% vs. 87.87%, 90.87% ）（P0.05 ）；方法B获得的细胞数显著高于 7 7 7 方法A和C （1.06×10 vs. 0.74×10 , 0.86×10 ）（P0.05 ），但耗时显著低于方法A 和C （236.67min vs. 260.00min ，268.33min ）（P0.05 ）。结论：方法A可获得较 高膜细胞纯度和细胞活力，本实验为进一步研究膜细胞的功能提供了基础。 试验三：AMH对卵泡膜细胞上类固醇激素合成酶的影响及机制研究 FSH和AMH单独或是共同添加于卵泡膜细胞中48 h后，通过Real-time qPCR 发现：在猪卵泡膜细胞中，FSH和AMH无论是单独作用还是联合作用，对LHCGR 、 STAR 、CYP11A1、CYP17A1 以及3β-HSD 的表达均无