勋章菊花粉鞘色素及蛋白剖析.docVIP

勋章菊花粉鞘色素及蛋白剖析 　　摘要：为研究勋章菊授粉形式对种子形成的影响，对其花粉鞘及蛋白成分进行分析。结果表明，黄色花粉外层含有类胡萝卜素，经板层分析得到与标准样品β-胡萝卜素具有相同的比移值（Rf值）；经花粉表面蛋白色谱-质谱分析发现，大多为30～50 ku；通过搜索、比对蛋白质发现，其中较可信的蛋白有3种，它们的肽段属于驱动蛋白马达结构域，在各自有丝分裂过程中参与染色体的运动和主轴伸长。该结果可为研究菊科植物自交及异交的亲和机制提供理论依据。 　　关键词：勋章菊；花粉鞘；蛋白质；花粉；色素 　　中图分类号： S682.1+10.1 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）09-0332-02 　　勋章菊为菊科勋章菊属植物，花形奇特，花色多彩，花心具深色眼斑，形似勋章，具浓厚的野趣，是园林中常见的盆栽和花坛、及地被花卉植物，对勋章菊开展相关研究，为其在园林中应用开辟更广阔的前景。 　　植物开花后，须要经过花粉萌发、花粉管进入胚囊和配子融合等一系列过程才能完成受精作用[1]。其中，最为关键性的一步就是花粉在柱头上的识别，对完成受精起着决定性作用。马纪峰等研究表明，柱头通过分泌某些物质主动地参与花粉与柱头的识别过程[2]，而花粉粒的初始识别是由花粉鞘调节的，花粉鞘是由花药绒毡层分泌并沉积于花粉表面的中性脂类、碳水化合物、蛋白质和类胡萝卜素等组成的半固态覆盖层[3-4]。花粉粒和雌蕊柱头组织间产生的蛋白质则是识别作用的主要物质[5]。勋章菊的管状花之间的传花授粉有别于其他菊科植物，花粉表面的一些小分子组成的胞外层物质参与了花粉的水合反应。为了探明授粉形式（自花和异花）对种子形成的影响，本研究对勋章菊花粉鞘及其成分进行了分析，以期为研究菊科植物自交及异交的亲和机制提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　以红纹品种为材料，选取盆栽开花植株进行试验。 　　1.2 方法 　　1.2.1 花粉表面色素层析 取开放的红纹头状花序，小心摘取管状花8～10朵，用蒸馏水观察花粉鞘的剥离；用80%丙酮溶液将柱头上的花粉洗下，4 000 r/min离心后上清液即为花粉的色素提取液。取色素提取液10 μL点样于10 cm×10 cm的硅胶板上，以β-胡萝卜素为对照，在石油醚 ∶丙酮=65 ∶35的展开剂中展开15 min，取出硅胶板置室内晾干，在WD-9403型紫外仪下进行观察[4]。 　　1.2.2 花粉表面蛋白SDS取0.5 mL离心管加入60 μL提取缓冲液，取红纹头状花序，小心摘取8～10朵刚刚开放、柱头呈蜡烛状的管状花，放入离心管中，浸提2 h；取8～10朵柱头呈牛角状的管状花，观察是否附着花粉，选择无花粉附着的柱头置离心管中浸提2 h，摇匀后沸水浴10 min，静置，取上清液进行SDS电泳。电泳选择浓缩胶5%、分离胶8%、1.5 mm厚胶板[6]。 　　SDS采用DYY-10型电泳仪，1.5 mm胶板，提前配制8%分离胶及5%浓缩胶，制好后取蛋白上清液上样40 μL，室温电泳至溴酚蓝指示带距凝胶底边3～5 mm时停止。将凝胶放入染色液中染色1 h，置于脱色液（5%甲醇，7.5%冰醋酸）中脱至蛋白谱带清晰、背景颜色干净，用相机拍摄凝胶电泳图像[7]。 　　1.2.3 花粉表面蛋白质谱分析 将凝胶上目的蛋白条带切胶回收，放入1.5 mL离心管中，冷冻密封保存，采用Thermo Finnigan公司的离子阱液质联用仪（LCQ Deca XP plus）对样品进行LC-MS/MS分析[8]。胶的酶解和质谱分析委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。 　　2 结果与分析 　　2.1 花粉表面色素定性分析 　　在勋章菊开花中期和后期，会出现黄色和白色2种花粉，在显微镜下观察，黄色花粉表面附着1层黄色油性覆盖物，即花粉鞘，花粉鞘在水体中会快速释放，并作短暂的布朗运动（图1-a）。花粉鞘经过80%丙酮提取后，与标准样品（β-胡萝卜素）同时薄板层析，结果表明，花粉中所含的色素与β-胡萝卜素有相同的比移值（Rf，6.0/6.0=1）[9]。初步确定勋章菊花粉色素为β-胡萝卜素（图1-b、图1-c）。而白色花粉的花粉鞘中不含类胡萝卜素。 　　2.2 花粉表面蛋白SDS 　　取红纹花粉、柱头提取液进行SDS，结果（图2）表明，无论是蒸馏水提取还是样品缓冲液提取，对花粉和柱头表面蛋白的SDS结果影响不大。花粉表面蛋白大多为30～50 ku，在此区间内条带较粗，蛋白含量高；而柱头由于蛋白提取技术及蛋白含量低的原因，未能获得有效条带。 　　2.3 花粉表面蛋白质谱分析 　　用8% 分离胶对花粉表面蛋白进行SDS，切下的胶经酶解成肽段混合物后，进行色谱-质谱联用的LC-ESI MS/MS分