银杏4CL基因克隆及分析论文-毕业论文（设计）.docVIP

PAGE 学号:200724140210 本 科 生 毕 业 论 文（设 计） 题 目: 银杏4CL基因克隆及分析 作者姓名: 专业班级: 生物科学2007级02班 指导教师: 化学与生命科学学院 二零一一年五月 目 录 中文摘要 1 英文摘要(Abstract) 2 1 前言 3 1.1 银杏的基本情况介绍 3 1.1.1 银杏的植物学简介 3 1.1.2 银杏价值简介 3 1.2 4CL基因的基本情况介绍 4 1.2.1 4CL基因简介 4 1.2.2 银杏中的4CL基因 4 1.3 4CL基因研究新进展 4 1.3.1 4CL基因的作用 4 1.3.2 4CL基因的结构 5 1.3.3 4CL同工酶的研究 5 1.4 基因克隆的常用方法 6 1.4.1 根据已知序列克隆基因 6 1.4.2 根据已知探针克隆基因 6 1.4.3 未知序列的基因打靶 6 1.4.4 用特异抗体克隆基因 7 1.4.5 特异基因的功能克隆 8 1.5 脱落酸等植物激素对银杏类黄酮含量的影响 8 1.6 本研究的基本思路和研究意义 8 2 材料与方法 9 2.1 实验方案 9 2.1.1 实验方案的设计 9 2.1.2 技术路线 9 2.1.3 实验方法的选择 10 2.2 实验原理 11 2.2.1 RNA提取 11 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 11 2.2.3 反转录 11 2.2.4 简并PCR及RACE技术 11 2.2.5 TA克隆 12 2.2.6 大肠杆菌感受态 12 2.2.7 大肠杆菌的转化 12 2.2.8 阳性克隆的鉴定 12 2.3 实验材料 13 2.3.1 材料 13 2.3.2 主要试剂与药品 13 2.3.3 主要仪器与设备 13 2.4 实验方法 13 2.4.1 RNA提取液的制备 13 2.4.2 银杏叶片RNA的提取 14 2.4.3 银杏叶片RNA电泳检测 14 2.4.4 反转录 15 2.4.5 利用反转录得到的cDNA进行简并PCR操作 15 2.4.6 RACE操作 16 2.4.7 TA克隆 16 2.4.8 大肠杆菌感受态的制备 16 2.4.9 大肠杆菌的转化 17 2.4.10 阳性克隆的鉴定 17 2.4.11 测序 18 3 结果与分析 18 3.1 银杏叶片RNA提取 18 3.1.1 提取结果 18 3.1.2 结果分析 18 3.2 PCR扩增 19 3.2.1 扩增结果 19 3.2.2 结果分析 19 3.3 TA克隆 19 3.3.1 克隆后检测结果 19 3.3.2 结果分析 19 3.4 4CL基因测序 20 3.4.1 克隆后测序结果 20 3.4.2 结果分析 21 4 讨论 22 4.1 讨论 22 4.2 有待进一步研究的问题 22 参考文献 24 致谢 26 银杏4CL基因克隆及分析 PAGE 24 银杏4CL基因克隆及分析 李琼 化学与生命科学学院 生物科学专业 200702班 摘要：本文从裸子植物银杏叶片中提取出总RNA，将总RNA进行反转录得到cDNA，再利用简并PCR技术扩增得到银杏4-香豆酸：CoA连接酶（4-coumarate: CoA ligase，简称4CL）基因片段，然后采用RACE技术进行基因全长的扩增。得到4CL全长基因后利用TA克隆技术测序得到基因的核酸序列、预测氨基酸序列和cDNA预测蛋白质3D结构图。核酸序列结果显示4CL基因片段全长787 bp，编码211个氨基酸。由此序列推导的氨基酸序列中，并不存在4CL蛋白特有的保守序列，但含有两个底物结合域。4CL是类黄酮生物合成过程中的关键酶之一，因此4CL基因的表达量高低及活性大小会影响类黄酮含量的高低，希望能为4CL基因的相关研究提供一些理论依据。 关键词：银杏；4-香豆酸：CoA连接酶；RNA；PCR技术；类黄酮 Cloning and analysis of 4CL Gene in Ginkgo biloba LI Qiong Class200702, Biology, College of Chemistry and Life Science, HNU Abstract: In this passage, we first take total ribonudleic acid from leaves of Ginkgo biloba, then get cDNA from reverse transcription. We get 4-coumarate: CoA ligase gene from degenerate PCR after that. At last, using rapid-amplification of cDNA ends techno