小麦分子伴侣TaTCP22基因克隆及特性剖析.docVIP

小麦分子伴侣TaTCP22基因克隆及特性剖析 　　摘要： 非生物胁迫可引起蛋白的功能紊乱，维持蛋白的功能构象和阻止非天然蛋白的聚合，对于细胞存活很关键。伴侣素可以帮助蛋白质在胁迫条件下复性，在植物抵抗非生物胁迫中扮演着非常重要的角色。为分析伴侣素TaTCP22的分子特性，解析伴侣素的胁迫响应机制，以小麦的cDNA为模板扩增得到TaTCP22 ，利用生物信息学方法分析小麦TaTCP22 的分子特性，使用MEGA5对小麦TaTCP22蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间的系统进化树；利用GSDS和PHYRE2在线工具分别对小麦TaTCP22 基因结构和三级结构进行分析；从Phytozome数据库中获取小麦TaTCP22 上游2 000 bp序列作为启动子，用PLACE数据库对小麦TaTCP22 启动子的顺式作用元件进行分析；利用实时荧光定量PCR检测TaTCP22 在不同组织及在脱落酸（abscisic acid，简称ABA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，简称PEG）、水杨酸（salicylicacid，简称SA）、氯化钠（NaCl）、低温胁迫处理下的表达量；利用In-Fusion技术构建TaTCP22 -16318GFP载体，采用PEG介导法将外源基因转到小麦原生质体中，在激光共聚焦显微镜下观察基因定位情况。小麦TaTCP22 全长1 643 bp，基因编码区包含UTR区和13个内含子以及13个外显子；启动子元件分析表明，TaTCP22 包含多种逆境胁迫应答元件；亚细胞定位结果表明，TaTCP22蛋白主要定位在细胞核、细胞膜和细胞质中；实时荧光定量PCR结果显示，TaTCP22在不同组织中的表达水平不同；TaTCP22 对于多种非生物胁迫均有不同程度的响应，说明TaTCP22 可能参与了多种胁迫应答途径。 　　关键词： 小麦；分子伴侣；TCP-1；胁迫响应；亚细胞定位 　　中图分类号： Q785；S512.101 文?I标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）22-0027-05 　　小麦是主要的粮食作物之一，其生长发育、产量及品质受到干旱、低温、盐和病虫害等生物和非生物胁迫的极大限制。仅盐害就影响约20%的灌溉农业[1]，因此揭示小麦抗逆的分子机制，对提高小麦产量和品质有重要意义。非生物胁迫通常造成蛋白质功能紊乱，维持蛋白质的功能结构域和阻止与非功能蛋白质聚合是细胞在非生物胁迫下存活的关键。热激蛋白/分子伴侣是一类在细胞中帮助其他蛋白折叠、组装、运输、降解的蛋白质，在非生物胁迫下，可帮助其他蛋白质复性。热激蛋白/分子伴侣可分为5类：HSP70家族、伴侣素（HSP60）、HSP90家族、Hsp100/Clp家族、小分子热休克蛋白家族[2-3]。TCP-1属于伴侣素（HSP60）家族，伴侣素广泛存在于生物界，被分为2类：GroE（Ⅰ型）和伴侣素CCT（Ⅱ型）[4]。Ⅰ型是在细菌、线粒体、叶绿体中发现的，Ⅱ型是在古细菌和真核生物的细胞质中发现的[5]。CCT是一种广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋白，在肌动蛋白、微管蛋白的组装和折叠中发挥重要的作用，具有相同的双环背靠背垛叠结构（back to back stacked rings），由14～18个亚基组成，每个亚基的分子量约为60 ku。真核细胞的CCT由2个花托样结构构成，只有少数蛋白是与CCT结合的天然底物[6]。除哺乳动物睾丸中发现的一种组织特异性亚基类型CCTζ-2外，所有生物的CCT都由8个相同的亚基（α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ）构成[7]。Yamada等从红树林cDNA中克隆BsCCTα转化的大肠杆菌能增强对盐和渗透胁迫的忍耐性[8]。前期研究主要集中在CCT伴侣素的结构、功能及作用底物方面，且在动物中的研究较多，而对CCT在植物体中响应胁迫的功能研究较少。本研究从小麦中克隆到1个伴侣素基因TaTCP22，并对小麦TaTCP22 的生物学特性以及参与非生物胁迫的应答机制进行研究，为阐述CCT提高小麦抗逆性的分子机制提供理论依据。 　　1 材料方法 　　1.1 试验材料 　　小麦轮选987种子由西北农林科技大学小麦育种课题组提供。16318 GFP载体由笔者所在实验室保存。小麦播种在土中（蛭石、泥炭土体积比=1 ∶ 1），在温室适宜的条件中生长2周，取出后用蒸馏水将根冲洗干净，置于滤纸上进行干燥处理，将干燥后的整株放入液氮中冷冻10 min后取出并迅速保存到 -80 ℃ 冰箱中准备提取RNA。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因TaTCP22 的全长克隆 　　利用美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站的相关程序对测序结果进行比对，找出小麦TaTCP22 基因的全长序列，利用DNAMAN