AssayPrtl(细胞培养试验流程).docVIP

Assay Protocol 细胞培养 一、 仪器、试剂 仪器：细胞培养瓶，移液枪，枪头盒（5ml、1ml、lOOgl、10（il）, 移液管（5ml、10ml）,玻璃分装瓶（100ml、200ml 500ml）,高 压铝盒（离心管、冻存管），离心机（800转5min），倒置显微镜， 细胞计数板，水浴箱（37°C） , CO2培养箱（调整至37°C、5%CO2）。 试剂：DMEM, Serum, Trypsin, P.S.，Puromycin，DMSO。 二、 试剂配制 10ml Complete Media： DMEM 9ml； Serum lml； P.s. lOOgl. 10ml Frozen Media： Complete Media 8ml； Serum lml； DMSO lml。 Puromycin（2|ig/（il）: 6（ilPromycin/4ml CM 三、 具体操作 准备：取各种己消毒的培养用品（枪头盒、高压铝盒、分装瓶） 置于净化台面，紫外线消毒30分钟，Media、Trypsin、Serum、P.S.、 Puromycin从4°C冷藏拿出至室温待用（使用之前用75%酒精全面消 毒）。开始工作前先洗手、戴上乳胶手套，用75%酒精喷拭手至肘部。 紫外灭菌时间到后，将灯和风机打开，开始工作。将Media、 Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin去除封口处密封条，用75%酒精喷 拭全面消毒后拿进去待用（注意：使用之前，应充分摇匀）。合理摆 放所需物品，尽景减少手部的大幅度摆动，点燃酒精灯，配置100ml Complete Media:用10ml移液管吸取DMEM 10ml*9次至分装瓶中， 再吸取Serum 10ml至分装瓶中，再加入1ml P.S.用移液管吹打混后 待用。 辛将待处理细胞取出后，倒掉原存的培养基； 安装5ml移液枪头后吸取PBS5ml，每支细胞加入2.5ml,清洗细 胞代谢物和培养瓶底部（清洗不干净会使胰酶消化变难），清洗过后 倒掉PBS （垂直倾斜瓶各倒一次，一定要倒干净，防止残余PBS稀 释Trypsin，影响酶解效果）。 然后，每支细胞加入0.5tnl Trypsin，摇摆培养瓶使其充分覆盖瓶 底，待每一支培养瓶都加入Trypsin摇匀后，再从第一支开始，用力 拍打培养瓶，左右摇摆使细胞都被消化下来，不在贴壁，依次拍打各 支细胞，观察，使其全部都消化完全（注意：控制消化时间不要太久， 把握不好就要再显微镜下观察）。然后再加入3倍体积的Media 1.5ml 于培养瓶中，终止其消化。再确保枪尖无污染的前提下，同一种细胞 可以用同一个枪头来吹打细胞（仔细吹打培养瓶，尤其是边边角角）， 使其成为单细胞悬液。 提前用镊子准备出4ml离心管，对应每一支细胞，做好标记。再细 胞吹打完全后，用移液枪将细胞悬液转移至离心管中，用密封条封好 U。待所存细胞都转移至离心管后，①将待冻存的细胞放置于准备好 的碎冰中保存待用（合理放置防止染菌）；②将用于分瓶传代的细胞 先800转离心5min （离心过程中，每一支培养瓶中加入3.5ml Media） 后取出，去除封口膜，用酒精喷拭后（确保密封），打开瓶盖后烧瓶 口灭菌，小心倒掉上清后烧瓶口灭菌，然后加入1ml或1.5ml Media 吹打均匀（注意：不要产生大量气泡）后，对应各自的培养瓶，均匀 的进行一分二或一分三传代，摇晃均匀，观察后，放入002培养箱中 继续培养。 将①等待冻存的细胞悬液，进行800转离心5min。在此期间，配 制冻存液ep:10ml，可在用完的serum 15ml离心管中，加入8ml Media， lml serum, lml DMSO,吹打混匀后待用；然后用镊子取出对应的n 支冻存管，做好标记（名称、日期、 姓名首字母缩写）。 离心结束后，取出离心管，去除封口膜，用酒精喷拭后（确保密 封），打开瓶盖后烧瓶口灭菌，小心倒掉上清后，烧瓶口灭菌，然后 加入2ml配好的冻存液，吹打均匀后，进行1分2的冻存，待所有细 胞处理完全后，先至于-20°C中等待，然后转移至-80°C冰箱中保存， 并做好冻存记录 注意事项: 1、严格无菌操作，打幵/拧上瓶盖时一定要烧瓶口灭 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均 要用75%洒精擦拭瓶子的外表面，并靠近酒精灯火焰操作。 器皿使用前必须过火灭菌。 继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能 碰到废液缸。 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 四、细胞的冻存（补充） 先将冻存管放入4QC冰箱，约40min。 接着置于-20°C冰箱，约30-60min。 置于-80超低温冰箱（可保