RNA干扰Twist基因表达抑制H9402侵袭转移的实验研究.docVIP

RNA干扰Twist基因表达抑制HCC9402侵袭转移的实验研宄 钱明1朱东明2 (1.江苏省苏州市横泾医院215009;2.苏州大学附属第一医院 215006) 】R446.1 】A 】1672-5085 (2010)35-0084-03 】目的探讨RNA干扰Twist基因表达对肝细胞癌细胞(HCC9402)转 移的抑制作用。方法用脂质体转染法将表达siRNA-Twist的真核表达载体 pGenesil-l-Twist-siRNA (pTwist-siRNA)和空载体 pGenesil-l-Neg-siRNA (pNeg-siRNA) 导入HCC9402细胞，G418筛选阳性细胞，获得稳定转染的阳性克隆。观察 siRNA-Twist对Twist表达的沉默及对肝细胞癌细胞体外侵袭转移的抑制作用，采 用RT-PCR技术检测不同处理组细胞中TwistmRNA的表达水平，Western-blot测 定蛋白表达水平。建立不同组裸鼠原位肝细胞肝癌模型，观察Twist沉默对裸鼠 原位肝细胞肝癌转移的抑制作用。结果pTwist-siRNA组细胞内Twist mRNA及 Twist蛋白的表达被存效沉默。重组细胞基底膜(Matrigel)侵袭实验显示， pTwist-siRNA组、空白对照组、pNeg-siRNA组穿透基底膜细胞数分别为 (35plusmn;10)、( 219plusmn;72)、｛ 228plusmn;71｝个/高倍镜(times;200)， 前组明显低于后两组，差异分別有统计学意义(Plt;0.05)。裸鼠体内实验表明， pTwist-siRNA组的肿瘤转移结节、肝脏转移结节、腹水明显减少。结论RNA干 扰Twist基因表达对肝细胞肝癌细胞侵袭转移有抑制作用,Twist可能成为肝细胞 肝癌基因治疗的新靶点。 关键词】肝细胞肝癌Twist小干扰肿瘤转移 多个研究报道，Twist基因在多种恶性肿瘤中存在明显上调，Twist上调 的肿瘤容易出现远处转移、较深的肿瘤浸润深度和较差的预后 l-7LHotz等 8】 新近发现，肝细胞肝癌组织及高转移潜能的肝细胞肝癌细胞株存在Twist的明显 上调。我们推测，干扰Twist能抗肝细胞肝癌转移作用。 基于上述理论，木课题旨在研宄Twist干扰对肝细胞肝癌侵袭、转移的 影响，为抗肝细胞肝癌转移提供新的基因靶点。 材料和方法 1材料 1.1试剂 RPMI1640购于Hyclon公司，小牛血清购于杭州四季青公司， 胰酶为国产。质粒提取试剂盒购于AXYGEN,连接试剂盒RNA提取试剂、cDNA合 成及 PCR 扩增试剂,G3PDH 购于 TaKaRa； Lipofectamine 购于 INVITROGEN,质粒 提取试剂盒购于AXYGEN, MNIicell （小室）由MilliPore公司生产，Matrigel和6 孔板购于美国BD公司。Twist-shRNA-1和shRNA-1质粒由海口市人民医院王齐 全教授惠送，兔抗人多克隆抗体Twist购于SANTA CRAUZ公司。 1.2细胞株和裸鼠 HCC9402肝细胞肝癌细胞株购于中国科学院上 海生物研究所细胞库，细胞用含10%胎牛血清的RPMR1640培养基培养，细胞培 养条件为37°C恒温，饱和湿度和5%CO2,指数生长的细胞为实验对象。 取4周龄健康纯种BALB/c-nu/nu雌性裸鼠，体重18?22g,在海南医学 院动物实验中心SPF级饲养，称重，编号。实验对象共分为三组：pTwist-siRNA 组、空闩对照组、pNeg-siRNA组。 2方法 2.1基因转染及稳定表达细胞株的筛选HCC9402细胞在含奋10%小牛 血清的DMEM培养基中,37C、5 %C02条件下培养。用0.25 %的胰酶消化细胞后, 按每孔4times;104个细胞均匀加入96孔板中，培养至细胞85%?90 %汇合后，分 别转炎pTwist-siRNA和pNeg-siRNA质粒，具体操作按照脂质体转％试剂 Lipofectamine 2000说明书进行。转染24 h后将细胞以1 : 10比例传代，次日开 始用含有500mu;g/mLG418的培养基进行筛选培养，每3d更换-次培养基，连 续筛选3周，然后将获得的细胞克隆，扩大培养。 RT-PCR 测定 Twist-shRNA-1 作用 HCC9402 细胞后 Twist mRNA 表达 按TRizol试剂盒（Invitrogen公司）说明书操作提取稳定转染pTwist-siRNA, pNeg-siRNA的细胞和空白对照组细胞的总RNA,取lmu;g RNA模按RT试剂盒说 明书反转录得到cDNA。引物序列 TwistUSGbphR^-GCAGACGACGGGTCAGATUSrsquc^-GACTGACCC