WesternBlt实验详细介绍.docVIP

Western Blot实验详细介绍(―)主要试剂的配制 细胞裂解液：根据目的蛋白所处的位置选择恰当的裂解液： 胞浆蛋白很容易提取，裂解液屮可以不添加任何去污剂； 跨膜蛋0由于膜成分的干扰，就需要添加适当的去污剂，例如选取NP-40 裂解液或者RIPA缓冲液； 与细胞骨架结合的一些蛋白的提取则需耍添加如SDS等强去污剂。 核A蛋白的提取口」以选择RIPA缓冲液。 注：Trizd提取的方法在实践中也常常采用，但是会对蛋白质的质量有一定影响，所以此种 方法慎用。 2.30%(w/v)聚丙烯酰胺：取290g丙烯酰胺，10gBIS(T叉双丙烯酰胺)，力U600ml 去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将溶液定容至1L,用0.45pn滤器滤去杂 质，于棕色瓶中4C存放。 消化道、呼吸道、皮肤粘膜等多种接触途牦，可导致遗传物质损伤和基因突 变，具有神经毒性，可致癌。 3.10%(w/v) SDS：取10g高纯度的SDS，加80ml去离子水，68°C加热溶解，缓慢 加入浓盐酸至PH7.2，加蒸馏水至100mL，室温保存。SDS属于强去污剂。 1.5mMTris-HCL(pH8.8)：取 181.7g Tris-base,加800ml去离子水，充分搅拌溶 解缓慢加入浓盐酸至PH8.8,让溶液冷却至室温，加蒸馏水至1L，高温高压灭菌 后，室温保存。 0.5mMTris-HCL(pH6.8)：取60.6g Tris-base,力U800ml去离子水，充分搅拌溶 解缓慢加入浓盐酸至PH6.8,让溶液冷却至室温，加蒸馏水至1L,高温高压灭菌 /n f室温保存。 10%(w/v)AP (过硫酸铵)：提供W种丙稀酰胺聚☆所必须的自由基。取lg过 硫酸铵，加10ml去离子水后充分溶解，4°C避光保存。 注：最好临用前配制，4C保存1周。超过期限会失去催化作用。对皮肤粘膜有刺激性和腐 蚀性。 TEMED （四甲基乙二胺）：催化AP形成0由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。 PH太低时，聚合反应受到抑制。注：TEMED味道很难闻，每次取200叫左右放入一 个干净的离心管中，4C存放。极易挥发，用完一定要盖紧盖子！ SDS加样缓冲液:pH6.8Tris缓冲液、甘油、SDS、巯基乙醇（高毒、 杀虫剂原料、笏爆品，新鲜配制！）、溴酚蓝浞匀备用。 lOxTris-甘氨酸电泳缓冲液：3O.3gTris，188g甘氨酸，lOgSDS,用蒸馏水溶解 至1000ml,得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。 lx转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9gU?氨酸、5.8gTris、0.37g SDS, 并加入200ml甲醇，加水至总量1L。提前配制。注：甲醛先不加，先将其他配好的溶 液搅拌，在开始转膜时，再讲甲醛加进去搅拌。 NaN3 0.02%叠氮钠（有毒，戴手套操作）：溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）,可以 防止抗体失活，但会稍影响结合效率，并使HRP失活。 TBST（洗脱效果好）：配制1 LTBST：量取100 ml 10x TBS + 900 ml超纯水+ lml Tween20o 脱脂奶粉封闭液：lOOmlTBST中加入5g脱脂奶粉，搅拌均匀。 （二）蛋白样品制备 1、 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 倒掉培养液预冷的PBS洗涤细胞弃去洗液加裂解液（PMSF 100mM/PI 1:100）,吹匀置于冰上。4冰上裂解30min （不要超过lh）,为使细胞充分裂解要 经常弹细胞。于4°C下12000rpm离心10min。一＞离心后的上清取lid测浓度，其 余加loading煮样后分装放于-20°C保存（1周），-80°C （1月-1年）。 注：细胞破碎多采用物理方法，如反复冻融法、冷热交替法、超声波法等。 2、 组织中总蛋白的提取： 用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，将少量组织块置于1?2ml匀浆器屮球状部位匀 浆使组织破碎。然后按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解 液。（如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品， 可以适当减少裂解液的用量。）裂解30mhiG,即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然￡；在4°0卜*12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中。 注：组织的破碎多采用机械破碎法，如电动捣碎机或匀浆机。使用匀浆机时要注意机器功 率的选择，太大也会破坏组织。 特别注意的是：①实验期间将蛋白样本保存于冰上；②每份样本吸取均使用新 的、一次性吸头；③操作中配戴手套以防止其他蛋白以及蛋白酶的污染；④不 要剧烈震荡或过度用力吸取，以减小蛋白变性可能性。 （三）蛋白含量的测定 蛋白定量的方法很多，如紫外光吸收法、双缩脲法、Bradford、BCA、Lorry 法等。其