快速展示糖苷水解酶活性架构单点突变导致结合力变化的电泳技术.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2018, 45(5): 560~566 速展示糖苷水解酶活性架构单点突变 导致结合力变化的电泳技术* 秀芸 刘淑萍 赵 越 陈冠军 王禄山** ( 东大学微生物技术国家重点实验室，济南250100) 摘要 酶分子在长期进化过程中形成一系列氨基酸残基组成的活性架构，参与底物的识别、结合与催化过程，而活性架构中 相应氨基酸残基是如何影响酶分子结合底物的能力，进而影响酶分子的催化效率，一直是酶分子理性改造研究的热点 利用 亲和电泳技术，可以快速展示内切纤维素酶 Cel 12A 和木聚糖酶 XynA 活性架构中不同突变体的催化活性及其迁移率的 Tr Tl 化，进而通过在不同底物浓度凝胶中蛋白质相对迁移率 化程度的定量回归分析，发现由氨基酸单点突变导致蛋白质迁移 率的相对 化，可以定量表征酶分子突变前后结合底物能力的 化 亲和电泳测定的有效阻滞常数Kb 值与等温滴定量热法 和荧光光谱法测定的相关参数比较具有明显相关性 由于亲和电泳技术在测定酶分子与底物的结合能力时具有简便、快速、 灵敏的特点，因而可作为常规生化实验室常规普筛技术来检测突 文库中系列突 体导致结合力的 化 关键词 亲和电泳，结合力，定量测定，等温滴定量热法，荧光光谱法 学科分类号 Q81，Q93 DOI: 10.16476/j.pibb.2017.0342 酶分子是自然界中高效的催化剂，其高效催化 方法是定量生物大分子相互作用的精确方式，可以 的结构基础是酶分子可与底物结合形成酶- 底物 直接测得结合常数( )及 、 等参数的 化， K a 驻H 驻S (ES)复合体，因此定量测定酶分子活性架构氨基酸 这有助于分析酶分子与可溶性多糖、寡糖链以及单 [1] [7] 与底物的结合力是探索其构效关系的基础 酶分 糖之间相互作用及其识别结合机制 由于催化过 子特异性识别和结合底物是一物理学过程，未涉及 程常常伴随放热或吸热现象，为了消除催化过程的 化学键的断裂 酶分子是通过其活性架构中不同位 影响，在利用ITC 测定结合力的 化时常常需要 点氨基酸残基结合底物对应功能基团，从而完成对 将催化残基进行定点突 ，因而会影响酶分子与底 底物的识别、结合和催化，因此对活性架构中不同 物的结合能力 氨基酸残基与特定底物结合能力进行定量研究可以 早在 1960 年，人们即利用电泳技术来研究血 [2-3] 2+ 2+ [8] 用于指导酶分子的理性设计与改造 清白蛋白(serum albumin)与Ca 和Zn 的相互作用 . [9] 纤维素酶活性架构中含有较多的芳香族氨基酸 到 1973 年，亲和电泳技术被提出 ，可以表征分 残基，因而 -H 作用在底物识别和结合过程中扮