一种新的基于Red重组及I-SecI体内切割的大肠杆.PDFVIP

114 生 物 工 程 学 报 朱美勤 等/一种新的基于Red 重组及I -Sec I 体内切割的大肠杆菌基因组无痕删减方法 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn January 25, 2016, 32(1): 114−126 DOI: 10.13345/j.cjb.150084 ©2016 Chin J Biotech, All rights reserved 生物技术与方法 一种新的基于Red 重组及I-Sec I 体内切割的大肠杆 菌基因组无痕删减方法 1,2 1,2 1 2 朱美勤 ，虞剑 ，周长林 ，方宏清 1 210009 2 100071 , , , . Red I -Sec I . , 2016, 32( 1): 114– 126. Zhu MQ, Yu J, Zhou CL, et al. Markerless DNA deletion based on Red recombination and in vivo I -Sec I endonuclease cleavage in Escherichia coli chromosome. Chin J Biotech, 2016, 32( 1): 114– 126 . 摘 要: 目前常用的基因修饰方法是在Red 同源重组介导下，电转线性PCR 片段替换染色体上指定序列。因 PCR 过程错误掺入，该方法常常会在同源序列部位产生一些突变。为了避免此类突变，我们建立了一种新的 无痕删除方法。首先将含有抗性标记 (两侧带有I-Sec I 识别位点) 的线性DNA 电转到Red 重组感受态细胞内， 用抗性基因替换基因组上指定序列；然后，将携带融合同源臂 (两侧带有I-Sec I 位点) 的供体质粒导入上述细 胞，诱导表达 I-Sec I 内切酶切割供体质粒释放同源片段，同时切除染色体上抗性基因产生双链断裂，通过分 子间同源重组实现无痕删除。我们应用该方法连续删除了大肠杆菌DH1 基因组上 11 个非必需区，使基因组减 小 10.59%。PCR 测序证明所有删减区域同源臂未发生突变，基因组重测序证明指定区域被删除。删减菌的生 长变化不大，但耐酸能力有所改变，并对番茄红素合成有不同影响。 : 大肠杆菌DH1 ，Red 同源重组，无痕删除 Received: February 10, 2015; Accepted: March 24, 2015 Corresponding author: Hongqing Fang . Tel: +86- 10 E-mail: fanghongqing@ Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CBA00800), National Natural Science Foundation of China (No..