锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因克隆及生物信息学剖析.docVIP

锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因克隆及生物信息学剖析 　　摘 要：为研究锦鲤疱疹病毒3型（KHV-3）ORF126基因编码蛋白的功能，我们对该蛋白的结构特征进行研究分析。本实验采用PCR扩增技术获得KHV ORF126基因的完整序列，构建pMD19-T-ORF 126重组质粒，应用生物信息学方法分析ORF126基因编码蛋白的理化特征。结果显示：KHV ORF126基因翻译合成273个氨基酸；ExPasy预测该蛋白的理论分子量为29.9 kDa，等电点为5.11；信号肽的切割部位最可能位于第19～20位氨基酸之间；跨膜区位于第145～168位氨基酸；抗原表位预测显示抗原性良好；编码蛋白不含N-糖基化位点，含有4个O-糖基化位点和17个磷酸化位点。 　　关键词：锦鲤疱疹病毒；ORF126基因；生物信息学 　　锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）感染锦鲤、普通鲤鱼及其变种，该病具有高传染性和高致病性等特点，春夏秋季节为高发期，该病一旦暴发，难以控制，致死率高达80%～90%，给工业化水产养殖造成严重的经济损失[1-2]。锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒3（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）引起的传染病，属于异疱疹病毒科鲤鱼病毒属，是一种线性、双链DNA病毒，基因组大小约为295 kb，含有156个开放性阅读框（ORF），成熟的病毒粒子呈球形，由40种蛋白质组成，包括13个囊膜蛋白、3个核衣壳蛋白、2个间质蛋白及22个未分类蛋白，病毒核内的电子密集区疑似由病毒基因组组成的核蛋白[3]。 　　1998年从美国和以色列首次分离得到KHV；2002年4月在我国广东省某养殖场首次发现KHV感染，死亡率高达80%以上，后经刘荭等用nested-PCR检测证实导致锦鲤死亡的病原体为KHV[4]；2008年，Rosenkranz等人成功构建KHV ORF81原核表达载体，并通过实验验证表达的ORF81重组蛋白可用于KHV DNA疫苗的研制；2010年，柯浩等人克隆出囊膜蛋白基因ORF59并高效表达[5]；2011年，周井祥等人成功克隆得到KHV-CJ株ORF81基因并对其编码的蛋白进行生物信息学分析，为基因工程疫苗的研究奠定基础[6]。目前，对KHV基因组编码蛋白功能的研究相对滞后，仅部分较保守的主要囊膜蛋白基因的克隆及免疫原性分析取得进展。随着生物信息学技术的迅速发展，蛋白质分子的特异性研究越来越便捷[7-8]。 　　本实验以河北省水产养殖病害防治监测总站所提供患病锦鲤组织为原料，提取基因组，nested-PCR鉴定KHV的存在，以所提基因组为模板，成功构建pMD19-T-ORF126重组质粒，应用生物信息学软件对ORF126基因编码蛋白的理化性质进行分析，为进一步研究KHV的特异性检测和基因工程疫苗奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 病毒、菌株与载体 　　患病锦鲤组织由河北省水产养殖病害防治监测总站提供，pMD19-T载体和E.coli DH5α感受态细胞均购自石家庄天时生物技术有限公司。 　　1.2 主要试剂 　　Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶、5K DNA Marker、15K DNA Marker等均购自石家庄天时生物技术有限公司；基因组提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自上海索宝生物科技有限公司。 　　1.3 引物的设计与合成 　　根据NCBI公布的KHV ORF126基因序列，利用Primer Premiers 5.0软件设计ORF126基因的特异性扩增引物（见表1），并引入EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶位点（划线部位），送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　1.4 锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因的PCR扩增 　　以KHV基因组为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：10×buffer（含Mg2+），2.5 μL；2.5 mM dNTP，1 μL；10 μM ORF126 F，1 μL；10 μM ORF126 R，1 μL；模板，1 μL；Taq DNA聚合酶，0.5 μL；ddH2O，18 μL。反??条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，59.8 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环后，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 　　1.5 锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因的克隆及鉴定 　　按照凝胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行切胶纯化，连接pMD 19-T克隆载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，并命名为DH5α（pMD19-T-ORF126），送上海生工生物工程技术有限