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金属基质增强飞行时间二次离子质谱用于单细胞脂质剖析 　　摘要单细胞中化学成分的分析对细胞生长、信号转导、凋亡等生理过程意义重大。飞行时间二次离子质谱（SIMS）是一种高灵敏的表面质谱成像技术，具有较高的空间分辨率，已被用于细胞及微区域分析。然而，生物有机分子较低的离子化效率限制了oSIMS在单细胞分析中的广泛应用。本研究采用金属/基质增强方法，明显提高了脂质的离子化产率。镀金硅片上磷脂酰胆碱PC （0：0）标样在加入基质后，准分子离子峰强度增大为硅片上的65倍。相应基底上单细胞表面脂质信号同时增强，但由于细胞的不规则形貌以及复杂化学环境影响，脂质信号增强幅度较小。在此基础上，使用延时提取（Delayed extraction， DE）模式克服了细胞形貌带来的影响，进一步增强脂质信号，并获得了高质量的单细胞脂质成像图。此方法为研究细胞代谢及细胞环境相互作用提供了新的途径。 　　关键词单细胞分析； 脂质； 飞行时间二次离子质谱； 金属/基质增强； 质谱成像 　　1引 言 　　单个细胞在结构、组成及代谢等方面存在差异，这种差异带来的影响在组织、器官等的功能上均有所体现。针对多个细胞的常规分析方法测得的结果通常无法保留这些个体差异信息，难以准确评估及预测细胞的生理学行为，因此，单细胞分析引起越来越多的关注[1]。单细胞分析的一个重要内容是单细胞脂质分析。脂质代谢是细胞代谢的一部分，在外界环境刺激下，细胞代谢途径将发生改变，同时诱导脂质组分发生改变，例如丙肝病毒侵染细胞后，改变了胆固醇代谢，使得细胞内胆固醇代谢物链甾醇增多[2， 3]； 人体乳腺组织为了应对微环境的改变，其脂肪酸、磷脂酰肌醇等组成成分增加[]； 用谷物喂养的小鼠其脑部组织中胆固醇含量大大下降[5]。由此可见，脂质与细胞代谢过程密切相关，单细胞脂质分析对于理解细胞代谢过程具有重要意义。 　　单个细胞具有较小的尺寸（微米级）和极低的分析物量，这就要求单细胞分析手段具有极高的灵敏度及空间分辨率，因此，单细胞分析是一个大的挑战[6]。单细胞成像是单细胞分析最重要的领域之一，目前用于单细胞成像的技术主要包括光学显微镜[7，8] 、电子显微镜[9]、扫描探针显微镜[10]及质谱成像[11，12]等，这些技术为单细胞分析提供了丰富的结构、形貌及组分空间分布等信息[13，1]。质谱成像是一种非标记的化学成像方法，可以同时对多种成分进行成像分析[15，16]。目前的质谱成像技术主要包括基质辅助激光解吸电离质谱（MALDIoMS）[17]、解吸附电喷雾质谱（DESIMS）[18]及二次离子质谱（SIMS）[19]。MALDIoMS常用于组织成像，然而其空?g分辨率仍难以满足单细胞分析的需求，目前报道的最高横向分辨率为5 μm[20]。SIMS在质谱成像中具有最高的空间分辨率，其横向分辨率可达100 nm以下，适用于单细胞成像。飞行时间二次离子质谱（oSIMS）使用飞行时间检测器，具有较高质量分辨率。目前oSIMS用于单细胞分析已有报道[21～23]，但其对于生物分子较低的离子化产率一直是限制其应用的主要问题之一。为了提高二次离子化产率，主要从新型离子源[2]、激光辅助置后电离[25]以及基质增强[26]等方面展开研究。本研究利用MALDIoMS中常用的基质材料2，5二羟基苯甲酸（DB）和贵金属基底增强脂质分子在oSIMS检测中的离子化产率，并进一步优化仪器参数，以期获得高质量的单细胞成像结果。 　　2实验部分 　　21仪器与试剂 　　Denton电子束蒸发设备（美国Denton公司）； Petroff细胞计数器（美国ausser公司）； 冷冻干燥机（北京四环公司）； 飞行时间二次离子质谱（oSIMS，德国IONO公司）。 　　醋酸铵、丙酮、乙醇、2O2及2SO（分析纯，上海凌峰化学试剂公司）； 磷脂酰胆碱（PC （0：0）， 美国Avanti Polar Lipids公司）； 人乳腺癌MC7细胞（南京凯基生物公司）； 2，5二羟基苯甲酸（DB）、10% 胎牛血清（SigmaAldrich公司）； 其它试剂均为分析纯。实验用水由MilliQ超纯水系统（美国Millipore公司）制备。硅片（1 cm×1 cm， 北京中镜科仪有限公司）。 　　22实验方法 　　221样品前处理硅片依次在丙酮、乙醇和水中超声30 min，用去离子水吹洗后，氮气吹干，然后用电子束蒸发仪先镀3 nm钛，再镀30 nm金。洗干净的硅片及镀金膜的硅片在Piranha洗液（2SO2O2，3∶1， V/V）中清洗30 s除去表面有机物，再用去离子水冲洗，氮气吹干。磷脂PC （0∶0）加正癸烷溶解， 配制成2 mmol/L的溶液，并用水稀释至50 μmol/L。 　　222细胞培养人乳腺癌MC7细胞