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金黄色葡萄球菌肠毒素实验剖析 　　金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都能分离到。健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等也常带有产肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株，因此，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒问题是个世界性卫生问题，在美国由其引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%［1］。我国每年发生的此类中毒事件全国各地都有报道。金黄色葡萄球菌肠毒素是一类结构、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5种（其中血清型SEC又分为SEC?1、SEC?2、SEC?33种亚型）早已被鉴定的传统血清型外，近年来还发现了SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO和SEU等新型的肠毒素［2-7］。本实验对一起食物中毒事件中分离到的13株金黄色葡萄球菌分别用全自动酶联荧光免疫分析法（VIDAS法）、反向胶乳凝集试验法（RPLA）及聚合酶链式反应法（PCR）进行肠毒素检测，并对这3种方法的检测结果进行分析，最后用DNA指纹图谱法对其进行同源性比对，从而了解金黄色葡萄球菌肠毒素的分布情况。?? 　　 　　1材料与方法? 　　 　　1.1材料? 　　1.1.1菌株来源实验所用的13株菌株均来自杨浦区疾病预防控制中心，是从一起食物中毒采集标本中分离所得，并已鉴定为金黄色葡萄球菌。其中1号和2号菌株从2位病人的肛拭中分离得到，其余9株从与这起食物中毒有关的环节中分离得到，包括炊事员的手、外环境等。? 　　1.1.2仪器与试剂mini VIDAS 全自动酶联荧光免疫分析仪、RiboPrinter指纹图谱仪为美国杜邦公司产品；PCR预混反应液购自上海皓嘉科技发展有限公司,寡核苷酸引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；金黄色葡萄球菌肠毒素反相被动胶乳凝集试验（RPLA）试剂盒购自OXOID公司。? 　　1.1.3引物选择根据 Becker等［8］报道合成SEA、SEB、SEC、SED、SEE 基因的PCR引物；根据Jarraud 等［9］报道合成SEH、SEI、SEG基因的PCR引物；根据Steven等［10］报道合成SEJ基因的PCR 引物,见表1。 ?? 　　 　　1.2方法? 　　1.2.1测定肠毒素将分纯的金黄色葡萄球菌接种于BHI肉汤，37℃震荡培养过夜。次日以3000 r/min离心15 min，取上清液2mL再次离心后，将1mL上清液加到1 mL提取缓冲液中混匀，然后取0.5 mL上述混匀液加入SET 2试剂条孔内，用VIDAS 全自动定量酶联荧光免疫测试系统检测肠毒素。? 　　1.2.2RPLA法肠毒素分型用Oxoid公司的RPLA试剂盒检测A、B、C、D 4种类型肠毒素，根据试剂盒说明书方法检测。? 　　1.2.3PCR法肠毒素分型①模板DNA的制备将平板上的纯菌落加入到100μL裂解液中，100℃裂解10min，然后以12 500 r/min离心10min，取上清液即为PCR扩增模板。 ②PCR扩增扩增反应总体积为25 μL，其中预混反应液12 μL，模板DNA 2 μL，上游引物(10μmoL/L)1 μL,下游引物（10μmoL/L）1 μL，灭菌双蒸水9 μL。DNA扩增反应条件如下：预变性94℃ 5min，然后进行35次循环的94℃变性 1 min， 55℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延长延伸时间至10 min。上述引物包括SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ 9对引物。③电泳PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1.5%，所用的DNA标准分子量（Marcker）购自美华生物工程公司。 ④凝胶成像用凝胶成像仪（中国天能公司）观察PCR扩增条带，并拍照留存。? 　　 1.2.4基因指纹图谱的测定提取13株金黄色葡萄球菌DNA后，选择EcoR I内切酶试剂盒，用Ribo Printer??全自动微生物鉴定系统进行基因指纹图谱的测定，操作步骤按操作手册进行?? 　　 　　2结果? 　　 　　2.1VIDAS测定肠毒素? 　　经过上机快速筛选，13株菌株中8株金黄色葡萄球菌肠毒素检测阳性。RPLA试剂盒进行分型试验，结果有2株鉴定为A型，1株为B型，1株为C型，2株为D型。PCR基因分型结果为4号菌株同时带有肠毒素A、E型基因，5号菌株同时带有肠毒素D、I、G、J型基因，8号菌株同时带有C、D、I、G、J基因，见表2。?? 　　 　　2.2电泳? 　　金黄色葡萄球菌肠毒素基因SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ扩增片段大小和文献报道一致，电泳图见图1。