代谢轮廓分析飞秒激光诱变米根霉高产富马酸菌株-生物化工专业论文.docx

摘 要 富马酸是一种典型的 C4 二羧酸平台化合物，被美国能源部列为二十一世 纪优先发展的 12 种平台化合物之一，广泛应用于食品、化工、医药、涂料等行 业。目前工业上富马酸主要通过顺酐异构和糠醛氧化等化学方法制得，其工艺过 程普遍存在生产条件苛刻、催化剂毒性大、环境污染严重等缺点。随着资源、能 源、环境危机的日益加剧，利用发酵法合成富马酸，提高产品附加值是实现富马 酸行业可持续发展的必然选择。 目前，根霉属丝状真菌是富马酸生物合成的最佳种属，但由于丝状真菌重组 基因不易表达，特异性重组频率低，基因工程手段在其菌种改造方面仍很困难。 因此，本工作将飞秒激光技术作为一种诱变方法应用于改良米根霉菌株提高富马 酸产量的研究中，在最优的飞秒激光诱变条件下 40 mW、15 min，获得的正突变 株 FM19 其产量为 49.4 g/L、转化率达到 0.56 g/g，分别为原始菌株 Wild1.22 的 1.56 倍和 1.37 倍；副产物乙醇的量从 13.2 g/L 减少到 6.7 g/L，苹果酸的量从 2.3 g/L 增加到 3.8 g/L。 为了探究高产富马酸菌株胞内生理代谢特征，利用基于气质联用的代谢轮廓 分析技术科学地理解高产富马酸突变株的代谢组特征。在产酸速率差异较大的两 个时期，对原始菌种 Wild1.22 和高产菌株 FM19 胞内代谢物进行测量和比较解 析。气相色谱-质谱联用仪一共检测出 61 种胞内代谢物，主成分分析（PCA）表 明高产菌株和原始菌株的胞内代谢存在明显差异，进一步结合米根霉的代谢网络 深层次分析发现高产富马酸米根霉菌株 FM19 中心碳代谢（柠檬酸途径、糖酵解 途径）及氨基酸代谢的水平高于原始菌株。特别地，在产酸稳定期，FM19 胞内 的 4-氨基丁酸和氨基乙酰丙酸的水平分别高于 Wild1.22 的 10.33 和 7.22 倍，这 些生理代谢特征使高产菌株 FM19 在产酸稳定期具有更高的产酸性能和细胞活 力。此外，FM19 胞内较高的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比率，可能导致高产菌 株具有更高效的富马酸转运能力。这些发现从代谢水平解释了飞秒激光诱变的高 产富马酸米根霉 FM19 高效产酸性能与胞内的生理代谢的关系，深入理解了高产 菌株胞内生理代谢特征。 关键词：飞秒激光诱变 富马酸 米根霉 代谢轮廓分析 气相色谱-质谱联用 丝状真菌 ABSTRACT Fumaric acid serves as a typical platform chemical (a carbon-carbon double bond and two carboxylic acid groups) and has been identified one of the top twelve building block chemicals in the 21st century by the US Department of Energy. Fumaric acid is produced chemically from maleic anhydride by isomerization and oxidation of furfural at present, but the process need severe reactive condition, poisonous catalyst, serious environmental pollution. While considering the environmental and energy crisis, it is of great urgency to develop a biological fermentation process for fumaric acid from renewable resources. Nowdays, rhizopus species were the best-producing ones for fumaric acid production, but the species are limited by genetic engineering due to low efficiency of recombinant DNA and site-specific recombination frequency. In this work, femtosecond laser irradiation technology was first employed in Rhizopus oryzae, a positive mutant FM19 was obtained, w