代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能-发酵工程专业论文.docx

摘要 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII!IIIIIIII II Y1889738 摘要 随着石化燃料的日益减少，酒精作为…种清洁可再生的新型能源成为当前各国研究 的热点。利用基因工程及代谢工程技术对工业酒精酵母进行改造，可提高菌种的发酵性 能，降低酒精的生产成本。本论文以此为出发点，将 Crel/oxp 重组酶系统与 rDNA 位点 问源意组相结合应用于工业酒精酵母，从以下三个方面对工业酒精酵母进行改造，并在 此基础上建立适用于工业酒精酵母的多基因改造策略。 首先，在酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 发酵生产乙醉的过程中，甘泊是一 种主要的副产物。减少甘油产量可提高乙醉产率和原料利用率。本研究中通过实验设计 出最佳的甘油淦径改造策略，在敲除工业酒精酵母甘油合成途径关键基因 GPDl 的问时 表达来源于蜡状芽抱杆菌的以 NADP+ 为辅酶的非磷酸化 L磷酸甘泊醒脱氧酶 (GAPN) ， 随后应用 Cre/loxp 重组酶系统剔除了构建重组菌时引入的抗性标记基因，接着通过 的NA 位点同源重组在该重组菌中过最表达了海藻糖合成酶(丁 PS) 及海藻糖磷酸化酶 (TPS) ，获得了重组工业酒精酵母AGIAl (gpd16::PPGKI-gapN， PPGK1-TPS1-TP S2)， 实 现了工业酒精酵母的多慕因改造。在葡萄糖浓度为 25%的底物发酵中，重组菌 AGIAl 的甘油得率下降了 76.0士0.2% ，酒精产最从113.3 gIL提高到 123.4 g1L，糖醇转化事提高 8.9士0.1%。更为重要的是重组菌 AGIAl 的最大比生长速率和葡萄糖消耗速率与白发株 工业酒精酵母相比基本不变，且该重组菌表现出了更好的耐高糖，耐酒精能力。 其次，作为目前生产酒精的主要原料，淀粉质原料如玉米，倒用大麦等含有较高浓 度的蛋白质(玉米: 10-13%; 饲用大麦: 15-18%) 。而酿酒酵母无外分泌蛋白酶，不能利 用原料中的可溶性蛋白。为提高酒精产率和原料利用卒，在本实验中，通过酿酒酵母表 面工程技术在工业酒精酵母细胞表团分别且现表达了其自身以及来源于粗糙脉抱霉 (Neuospora crαssa) 的酸性蛋白酶基因，获得意细菌 APB2 (PPGKJ-PEP4-AG1) 和 SA3 (PPGKrA罚p-AGl) 。在以玉米淀粉为基质的酒精发酵实验中，童组菌APB2 和 SA3 生长速 率和酒精发酵速幕均高于原始酒精酵母，酒精得率分别提高了 6.5士0.2%和 5.7::t:0.l%。发 酵结束时，重组菌 APB2 及 AS3 的酒精产量分别达到 126.0 gIL和 125.0 g/L 而出发株 工业洒精酵母仅为 118.2 g/L o 由于酵母来源的酸性蛋白酶更适合于目前的同步糖化发酵 工艺，因此选择该蛋白酶并继续应用 Cre/loxp 系统与 rDNA 位点问源重组在重菌株 AGIAl (gpdI6::PPGKrgap N， PPGK1-TPSI-TP S2)细胞表面进行表达，获得意组商 AGSl (gpd16::PPGKl-glαrpN，PPGK1-TPSI-TP S2PEP4-AG1) 。 另一方面，酒精发酵的糟液中含布一定蠢的纤维工糖未能被酿酒酵母有效利用。在 工业服酒酵母中引入纤维工糖代谢途径，提高原料利用率的问时也为以后的纤维素酒精 发酵打下基础。本研究中，分别在工业酒精酵母的细胞内，胞外和细胞表面表达了来源 于扣囊复膜抱酵母 (Saccharomycopsis fibuligerα) 的β葡葡糖背酶 BGLl 基因，并对所 得的重组菌 SBAl (PPGKrBGL1) ，SBBl (PPGKruF-BGLl) ，SBC2 (PPGKl-uF-BGLI-AGl) 进行了有氧条件下的纤维二糖发酵实验，初步说明工业酒精酵母不具有转运纤维二糖的 能力。而同时表达纤维工糖透过性酶和 β葡萄糖背酶的重组菌 BPS3 (PPGKJ-BGLl bglP) 摘要 不仅具有较好的转运纤维工糖的能力，且该菌株对纤维工糖的利用效率有了明显的提 高，在 96 h 内几乎用尽了 10 gIL的纤维二糖并产生 4.4 gIL的酒精。因此应用 Cre/loxp 系统和 rDNA 位点同源重组，在 AGSl (gpdl e.::PPGKI-伊rpN，PPGKI-TPSI-TP S2-PEP4..AG1) 中间时表达纤维二糖透过性酶和 β葡葡糖背酶，赋予该重组酵母利用纤维二糖的能力， 最终我得意组菌 AGPB3 (gpdl e.::PPGKrgapN，PPGKrTPSI-TP