雌激素对PES1的调节作用及相关机制研究-免疫学专业论文.docxVIP

青海大学 青海大学 2009 级攻读硕士学位研究生毕业论文 第 第 PAGE 2 页，共 53 页 HYPERLINK \l _bookmark0 二、实验方法 40 HYPERLINK \l _bookmark1 三、实验结果 41 HYPERLINK \l _bookmark2 四、讨论与小结 42 HYPERLINK \l _bookmark3 全文小结 44 HYPERLINK \l _bookmark4 参考文献 45 HYPERLINK \l _bookmark5 致谢 48 HYPERLINK \l _bookmark6 文献综述 49 HYPERLINK \l _bookmark7 攻读学位期间取得的研究成果 55 HYPERLINK \l _bookmark8 学位论文独创性声明 56 HYPERLINK \l _bookmark9 学位论文知识产权权属声明 57 中文摘要 雌激素对 PES1 的调节作用及相关机制研究 硕士研究生： 梁 宏 硕士生导师： 耿排力 教授 核仁(nucleolus)是普遍存在于真核细胞中的最重要结构。它是 rDNA 转录和 核糖体 RNA 的合成场所。如果说核糖体是合成蛋白质的“分子机器”，那么核仁 便是制造这一机器的“母机”。此外，核仁还具有另外的功能，包括一些小 RNAs 的核苷酸修饰，在信号识别颗粒的生物合成中,尤其在细胞周期以及细胞衰老等 过程中,可能发挥举足轻重的作用。国内外学者发现，核仁蛋白在恶性肿瘤中所 扮演的角色比较重要。而 PES1（又名 pescadillo）是核仁蛋白的一种基因，该物 质在斑马鱼胚胎发育的突变研究时被鉴现。PES1 已知的生物学功能主要包括参 与核仁生成和调控细胞周期,还有研究提示 PES1 与肿瘤的的发生发展密不可分。 本课题探讨在乳腺癌发生发展中,外源性雌激素对核仁蛋白 PES1 的调节机 制及 PES1 与 ER-ɑ 之间的相关性。 第 一 部分， 我 们对实 验 室现有 的 几种妇 科 肿瘤细 胞 系通过 蛋 白印迹 法 （Western blot）的方法检测其 PES1 的表达情况。同时，用免疫细胞化学和免疫 荧光检测认定 PES1 定位于乳腺癌细胞核内。 第二部分，乳腺癌细胞中加入外源性雌激素后，利用 Western Blot 技术检测 到核仁蛋白 PES1 的蛋白水平上调，且呈量效或时效变化，尤以乳腺癌细胞 BICR 和 ZR75 最为明显。随即，在 ER-ɑ（+）细胞系 BICR 和 ZR75 中分别敲低 ER-ɑ， 构建 ER 相对表达较低的环境，监测雌激素刺激后 PES1 的表达水平。通过 Western Blot 技术鉴定不同干扰位点的干扰效率，分组给予雌激素（雌二醇，E2）刺激（溶 剂对照、E2），24 小时后收集新鲜细胞，采用 Western Blot 技术，比较上述细胞 中 PES1 的蛋白表达情况。结果表明：敲低乳腺癌细胞 BICR 和卵巢癌细胞 SKOV3 中的 ER-ɑ 后，给予外源性雌激素刺激后，PES1 的表达水平并没有上调。 第三部分，为了研究 ER-ɑ 与 PES1 之间的关系，我们做了以下三方面的工 作。第一方面，在乳腺癌细胞 BICR、ZR75 和卵巢癌细胞系 SKOV3 中，通过瞬 时转染技术，敲低细胞中 ER-ɑ，用 Western Blot 检测 PES1 的蛋白表达水平。 发现： 每当 ER-ɑ 水平敲低时，PES1 也随即下调，而且在三种细胞中均有体现。 相反，我们将乳腺癌细胞 BICR 的 PES1 敲低，发现 ER-ɑ 的水平也有所下调。 正反两方面证明 ER-ɑ 与 PES1 有一定相关性。第二方面，为了验证 ER 对 PES1 的稳定性有无影响，敲低细胞 BICR 和 ZR75 中 ER-ɑ，构建 ER-ɑ 相对表达较低 的环境，分别在两个组（干扰 ER 和未干扰 ER）中加入放线菌酮（Cycloheximide ， 缩写 CHX），采用 Western Blotting 技术，以 GAPDH 为内参，比较上述细胞中 PES1 的表达情况。实验表明，在同一浓度 CHX 的作用下，两个组 PES1 随着时 间的推移，均在逐步降解，但是干扰 ER 的实验组 PES1 降解会更快。尤其以乳 腺癌细胞 ZR75 最为突出。第三方面，用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 技术来检测细胞 BICR 中 ER-ɑ 与 PES1 之间的相互作用。结果提示：ER 的抗体 可以不同程度地使蛋白 PES1 沉淀，说明在乳腺癌细胞 BICR 中内源性 ER 和