法舒地尔通过抑制血管内皮细胞阻止肿瘤血管新生的实验研究-肿瘤学专业论文.docx

法舒地尔通过抑制血管内皮细胞阻止肿瘤血管新生的实验研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心，武汉，430030 硕士研究生：张 哲 导 师：伍 钢 教授 中文摘要 【目的】 研究观察 Rho／Rho 激酶(ROCK)信号转导通路抑制剂——法舒地尔， 对肿瘤侵袭转移过程中内皮细胞侵袭能力，粘附能力和细胞骨架的影响。 【方法】 体外培养内皮细胞（HUVEC），将培养的 HSC 分为 5 组，对照组， fasudil40 umol/L 组，fasudil70umol/组，fasudil100umol/L 组，fasudil120 umol/L 组。采用 MTT 法检测 fasudil 对 HUVE 细胞增殖活性的影响，计算药物的半数 抑制浓度（IC50）, Transwell 小室侵袭实验测定药物对内皮细胞（HUVEC）跨 膜迁移数量的影响，用鬼笔环肽细胞骨架染色法检验药物对细胞骨架的影响。荧 光实时定量 PCR 检测药物干预后对 RHOAmRNA，PIGFmRNA,MMP-9mRNA 表 达的影响。Western 印迹检测 HSC 磷酸化肌球蛋白轻链[phosphorylated myosin light chain．p-MLC(Thrl8／Serl9)]的表达。 【结果】 Fasudil 的 IC50 为 867.12±12.6umol/L，取浓度 40 umol/L ,70umol/L， 100umol/L，120 umol/L 干预后，穿过人工基质膜的细胞由 253.65±3.21 降至 133.32±1.25，（P0.01）,药物作用后的细胞骨架微丝断裂，HUVEC 存在 RHOA 的表达，并且 RHOA 在转录水平和蛋白水平表达明显下降(P0.01)，下降程度与 细胞侵袭能力变化成正相关。 【结论】 HUVEC 存在 RHOA,PIGF,MMP-9 的表达，fasudil 能明显降低体外 HUVEC 侵袭和迁移能力，改变细胞骨架结构，阻止肿瘤粘附侵袭能力和运动能 力。 【关键词】 内皮细胞，法舒地尔, RhoA , P-MLC(Thrl8/Serl9), 细胞骨架 The inhibition of Human umbilical vein endothelial cells by Fasudil to prevent the angiogenesis of tumor Cancer center of Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology Master Candidate : Zhang Zhe Supervisor : Prof. Wu Gang Abstract 【Objective】 To observe the effects of fasudil，a Rho/ROCK signaling pathways inhibitor ， on adhesion ， migration and the changes in endothelial cytoskeletal reorganization. 【Methods】 HUVE cells were cultured in vivo.Cultured HUVEC were divided into 5 groups.Fasudil was added to 4 groups in a concentration of 40,70,100,120umol/L,respectively.The effect of Fasudil on proliferative activity of HUVE cells were measured by MTT,calculated the IC50.The inhibition of migration of HUVE cells was evaluated by a transwell chamber.The effect of Fasudil on the changes in endothelial cytoskeletal reorganization were evaluated by phalloidin.The expression of RHOA,PIGF,MMP-9 were measured by Real-time PCR.The protein levels of RHOA,p-MLC(Thrl8／Serl9) were assayed by Western blot. 【Results】 The IC50 of Fasudil were 867.12±12.6u