泛素连接酶RNF2与MANF的相互作用及其神经保护作用-药理学专业论文.docx

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 HYPERLINK \l _bookmark0 3.1.9 重组质粒的鉴定 26 HYPERLINK \l _bookmark1 3.1.10 质粒的中量提取 27 HYPERLINK \l _bookmark2 SIRNA 的合成 27 HYPERLINK \l _bookmark3 免疫印迹（IMMUNOBLOTTING，IB） 28 HYPERLINK \l _bookmark4 3.3.1 蛋白样品制备 28 HYPERLINK \l _bookmark5 3.3.2 SDS凝胶制备 28 HYPERLINK \l _bookmark6 3.3.3 上样电泳 29 HYPERLINK \l _bookmark7 3.3.4 转膜 29 HYPERLINK \l _bookmark8 3.3.5 IB 检测 29 HYPERLINK \l _bookmark9 RT-PCR 29 HYPERLINK \l _bookmark10 RNA 提取 29 HYPERLINK \l _bookmark11 RT 反应 30 HYPERLINK \l _bookmark12 PCR 扩增 30 HYPERLINK \l _bookmark13 酵母双杂交（YEAST TWO HYBRID，Y2H） 30 HYPERLINK \l _bookmark14 3.5.1 小规模转化酵母菌 31 HYPERLINK \l _bookmark15 3.5.2 酵母提蛋白 31 HYPERLINK \l _bookmark16 3.5.3 Bait－BD 与文库融合，筛选 32 HYPERLINK \l _bookmark17 3.5.4 酵母质粒 DNA 的提取 33 HYPERLINK \l _bookmark18 3.5.5 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 33 HYPERLINK \l _bookmark19 3.5.6 文库质粒 DNA 电转化大肠杆菌 34 HYPERLINK \l _bookmark20 3.6 细胞培养及转染 34 HYPERLINK \l _bookmark21 GST PULL DOWN 35 HYPERLINK \l _bookmark22 3.7.1 表达 GST 标签融合蛋白 35 HYPERLINK \l _bookmark23 3.7.2 表达 His 标签融合蛋白 35 HYPERLINK \l _bookmark24 3.7.3 纯化 GST 标签融合蛋白 36 HYPERLINK \l _bookmark25 3.7.4 纯化 His 标签融合蛋白 36 HYPERLINK \l _bookmark26 3.7.5 pull down 36 HYPERLINK \l _bookmark27 免疫共沉淀（CO-IMMUNOPRECIPITATION，CO-IP） 37 HYPERLINK \l _bookmark28 3.9 核浆分离实验 37 HYPERLINK \l _bookmark29 3.10 细胞免疫荧光染色 38 HYPERLINK \l _bookmark30 3.11 稳定转染细胞系的建立 38 HYPERLINK \l _bookmark31 3.12 PI 染色 38 HYPERLINK \l _bookmark32 3.13 脑组织免疫荧光染色 39 HYPERLINK \l _bookmark33 4 结果 40 HYPERLINK \l _bookmark34 4.1 诱饵表达质粒 PGBKT7-MANF 的构建和鉴定 40 HYPERLINK \l _bookmark36 4.2 诱饵质粒 PGBKT7-MANF 的毒性及自激活效应检测 40 HYPERLINK \l _bookmark38 4.3 检测 BAIT 阳性酵母克隆中 MANF 融合蛋白的表达 41 HYPERLINK \l _bookmark40 4.4 酵母融合与阳性克隆的筛选 42 HYPERLINK \l _bookmark42 4.5 阳性克隆基因序列的测定与分析 43 HYPERLINK \l _bookmark45 4.6 酵母回复性杂交 45 HYPERLINK \l _bookmark46 4.6.1 酵母表达质粒 pGADT7-RNF2 的构建与鉴定 45 HYPERLINK \l _bookmark48 4.6.2 酵母回复性杂交验证 MANF 和 RNF2 相互作用 45 HYPERLINK \l _bookm