曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶SmLAP的生物.doc

曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶(SmLAP)的生物信息学分析、 克隆及表达 杨祖婷基金项目:国家自然科学基金(NoNo；海南省自然科学基金(814289)作者单位:海南医学院热带医学与检验医学院，海南，海口，571101★通讯作者:梁培，Email:liangpeilp2012@163.com 基金项目:国家自然科学基金(NoNo；海南省自然科学基金(814289) 作者单位:海南医学院热带医学与检验医学院，海南，海口，571101 ★通讯作者:梁培，Email:liangpeilp2012@163.com [中文摘要] 目的 利用生物信息学方法分析曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶 (leucine aminopeptidase of Spirometra?mansoni, SmLAP) 基因的结构和功能，并将该基因克隆至原核表达载体在大肠杆菌中进行原核表达并纯化，为进一步研究其功能奠定基础。 方法 利用生物信息学相关软件，分析SmLAP基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。通过PCR扩增得到目的基因，克隆至原核表达载体pGEX-4T1中，转化感受态E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达的重组蛋白和利用GST标签层析柱纯化，纯化后的蛋白经12%SDS分析纯度。结果 曼氏迭宫绦虫LAP基因ORF finder结果显示核酸序列为1662bp，编码554个氨基酸，但信号肽预测结果显示在第21个氨基酸的位置出现信号肽。切除信号肽后核酸序列为1083bp，编码360个氨基酸，理论分子量为40kDa，与人的LAP基因序列相似性为38%。将SmLAP和人的B细胞抗原表位预测结果进行比对，发现相似度极低。另外，在大肠杆菌中成功构建原核表达载体pGEX-4T1-SmLAP，并通过超声破碎、尿素溶解包涵体、透析、GST层析柱等方法得到纯化蛋白。结论 亮氨酸氨基肽酶在原核表达系统中表达，并获得纯度较高的蛋白。此外，生物信息学分析结果提示SmLAP是一个有潜在研究价值的免疫诊断分子。 [关键词] 曼氏迭宫绦虫；亮氨酸氨基肽酶；生物信息学；原核表达；免疫诊断分子； Bioinformatics analysis, cloning and expression of leucine aminopeptidase of Spirometra?mansoni YANG Zuting, CHEN Liqiang, FU Ruijia, YIN Yiting, LIANG Peng, LU Gang, LIANG Pei★ (School of Tropical and Laboratory Medicine, Hainan Medical University, Haikou, Hainan, China, 571199） [Abstract] Objective To characterize the structure and function of LAP gene from Spirometra mansoni (SmLAP) by bioinformatics, and express and purify the recombinant SmLAP in prokaryotic expression system for the further studies of its functions. Methods The characteristics of the structure, biology and immunity of SmLAP were analyzed using several bioinformatic softwares. SmLAP gene was amplified by PCR and inserted into the prokaryotic expression vecter pGEX-4T1. The recombinant pGEX-4T1-SmLAP was transformed into E.coli for expression under induction by IPTG. The recombinant SmLAP (rSmLAP) was identified by 12%SDSand Western blotting analysis. Results The results of the open reading frame (ORF) showed that the nucleic sequence of SmLAP was composed of 1662bp, encoding 5