生物化学——蛋白质化学培训.ppt

高压液相层析 基质株更小，孔径更均一，基质填充更致密 二）电泳法 蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。 薄膜电泳 凝胶电泳 薄膜电泳 1、SDS电泳 2、等电聚焦电泳 3、双向电泳 1.SDS电泳 SDSSDS:十二烷基硫酸钠，阴离子去污剂 PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 步骤：破坏二硫键 加入SDS 上样 电泳 染色 回收 原理：多肽链的迁移率与其分子量的对数成反比 作图：标准蛋白分子量对数迁移率（线性） 原理： 基于蛋白质 分子大小 以及形状不同 载体： 聚丙烯 酰胺凝胶 The migration of a protein in a gel during electrophoresis is therefore a function of its size and its shape. SDS binds to most proteins in amounts roughly proportional to the molecular weight of the protein, about one molecule of SDS for every two amino acid residues. The bound SDS contributes a large net negative charge, rendering the intrinsic charge of the protein insignificant and conferring on each protein a similar charge-to-mass ratio. In addition, the native conformation of a protein is altered when SDS is bound, and most proteins assume a similar shape. Electrophoresis in the presence of SDS therefore separates proteins almost exclusively on the basis of mass (molecular weight), with smaller polypeptides migrating more rapidly. 染色（Staining） 银染 蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银结合显色，检测极限是 2～5.0ng／蛋白条带 染料染色 如考马斯亮蓝Coomassie blue）：三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。 2.等电聚焦（Isoelectric focusing) 等电聚焦：根据两性电解质等电点的不同来分离不同物质的方法。 3.双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis) 等电聚焦： pI不同 基质：pH不同的 凝胶柱 双向电泳： 将等电聚焦技术 和SDS技术 结合起来 三）离心法 速率区带离心(密度梯度离心) 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 速率区带离心法 管口到管底密度逐步升高 第七节 氨基酸顺序测定 Sanger法 1953年测定胰岛素的氨基酸顺序 氨基酸序列测定步骤 1、确定蛋白质分子中多肽链的数目 2、拆分并分离多肽链 3、分析每条肽链的氨基酸组成测定 4、每条肽链中氨基酸连接顺序 （1）肽链末端氨基酸残基的测定 （2）断裂多肽链并分离各肽段 （3）测定各肽段的氨基酸顺序 （4）确定每个肽段在多肽链中的位置 一、多肽链数目的确定 1、原理： 确定N末端（或C末端）残基 2、方法： 二硝基氟苯法（DNP法，Sanger试剂， N末端） 丹磺酰氯法（DNS, 强荧光剂，N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽)。 酶法（氨肽酶或羧肽酶） 二、拆分并分离亚基 1、破坏亚基间的非共价键 2、二硫键的断裂 3、分离多肽链 三、测定每条肽链的氨基酸组成及比例 1、水解（by acid hydrolysis） 2、分离AA（by ion exchange chromatography） 3、测定各AA含量(by colorimetric reaction） 四、水解肽链成肽段并分离肽段 裂解剂 裂解位点 胰蛋白酶 Lys、Arg（C端水解）