人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（５）：６～１１ 人呼吸道合胞病毒Ｍ蛋白非复制型 重组腺病毒的构建和鉴定 １ １，２ １ １ １ １ １ １ 尚　智 　何金生 　张　梅 　虞结梅 　陆燕燕 　谢　灿 　唐　倩 　魏　薇 （１安徽医科大学免疫学教研室　合肥　２３００３２　２北京交通大学理学院生物科学与技术研究所　北京　１０００４４） 摘要　人呼吸道合胞病毒（ｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）基质蛋白（ｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍ）在 ＋ ＲＳＶ形态发生上具有重要作用，因含有ＣＴＬ及ＣＤ４ Ｔ细胞抗原表位，在疫苗研究上具有一定意 义。为此，应用ＲＴＰＣＲ方法从感染ＲＳＶ的ＨＥｐ２细胞中扩增获得Ｍ蛋白基因，构建了含 Ｍ基 ? ? 因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示ＲＳＶＭ基因仅有一处碱基发生 错义突变。获得的非复制型重组腺病毒 ＦＧＡｄ／ＲＳＶＭ感染２９３细胞，观察到细胞出现 ＣＰＥ，ＲＴ? ＰＣＲ发现Ｍ基因有转录，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及间接免疫荧光分析检测到Ｍ蛋白。成功克隆Ａ亚型 ＲＳＶＬｏｎｇ株 Ｍ基因，并获得一株可表达 Ａ亚型 ＲＳＶＭ蛋白的非复制型重组腺病毒 ＦＧＡｄ／ ＲＳＶＭ，可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。 关键词　人呼吸道合胞病毒　Ｍ蛋白　非复制型重组腺病毒 中图分类号　Ｑ７８９ 　　 人 类 呼 吸 道 合 胞 病 毒 （ｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ 发生上具有重要作用，同时对宿主细胞的转录具有抑 ｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）广泛分布于世界各地，是引起婴幼 ［１］ 制作用 。为进一步开展 Ｍ蛋白的功能研究及寻求 儿呼吸道感染最主要的病毒性病原，老年人和免疫抑 ＲＳＶ疫苗研制的新方法，我们克隆了ＲＳＶＭ基因并完 制个体也是 ［１］ ＲＳＶ易感人群 。除了引起上呼吸道感 成了可表达ＲＳＶＭ蛋白的非复制型重组腺病毒的构建 染外，还是引起毛细支气管肺炎等下呼吸道感染的重 及鉴定。 要原因。一般首次感染多发生在一岁以内的婴儿，尤 其是２～６个月的婴幼儿，是造成婴儿期住院的主要原 １　材料与方法 ［２］ 因 。迄今为止，对ＲＳＶ的感染仍然缺乏有效的特异 １．１　材料和试剂 性预防和治疗方法，世界卫生组织及美国医学研究院 １．１．１　毒株和细胞　ＲＳＶ毒种（Ａ亚型Ｌｏｎｇ株）由首 有关２１世纪疫苗报告中均将开发 ＲＳＶ疫苗列为最优 都儿科研究所钱渊教授惠赠。人喉癌细胞株ＨＥｐ２细 ? 先发展的疫苗项目之一［３，４］。ＲＳＶ属于副黏病毒科， 胞系和ＣＯＳ７细胞系为本室保存。 ? 肺炎病毒属，为单股负链 ＲＮＡ病毒，基因组共编码 １１ １．１．２　菌株和质粒　Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５、ｐＧＥＭ ＴＥａｓｙ、 α ? 种蛋白，包括３种跨膜包膜糖蛋白（Ｆ