肺炎链球菌热休克蛋白GrpE的初步晶体学研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

重庆 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 (NH4)2SO4 英文名称 Ammonium sulfate 中文名称 硫酸铵 PEG Polyethylene glycol 聚乙二醇 DMSO Dimethylsulfoxide 二甲基亚砜 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 Q-PCR Quantitative Real-time PCR 实时荧光定量 PCR RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 CaCl2 rpm Calcium chloride Revolutions per minute 氯化钙 转每分 d Day 天 sec Second 秒 bp Base pair 碱基对 h Hour 小时 IPTG Isopropyl-D-1-Thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代半乳苷 OD Optical density 光密度 ng Nano-gram 纳克 ml Milli-liter 毫升 TAE Tris-acetate-EDTA TAE 缓冲液 Tris Tris(hydroxymethyl)- aminomethane 三羟甲基氨基甲烷 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 mM Milli-liter 毫摩尔每升 dNTP Deoxynucleosides triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸盐 1 肺炎链球菌热休克蛋白 GrpE 初步晶体学研究 摘 要 目的 热休克蛋白 GrpE 是热休克蛋白超家族 70 重要成员之一， 被认为是一种负性调控基因。该基因在肺炎链球菌的感染中有相关作 用。对肺炎链球菌热休克蛋白 GrpE 进行克隆表达，纯化及热稳定性 测定，以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。 方 法 设 计 特 异 性 引 物 ， 通 过 PCR 技 术 扩 增 目 的 基 因 。 构 建 pW28-GrpE 重组表达质粒。在大肠杆菌 (Escherichia coli, E.coli) B834 中获得可溶性上清表达。利用 Ni2+-NTA 亲和层析柱、DEAE 阴离子 交换层析柱、Hiload Superdex 75 凝胶层析柱对靶蛋白进行纯化。TSA 法测定 GrpE 热稳定性，气相扩散法获得蛋白质晶体。 结果 重组构建质粒 pW28-GrpE 可以在表达菌 E.coli B834 中获 得可溶性上清表达。GrpE 蛋白具有较高纯度(95%以上)，目的蛋白在 溶液中以二聚体形式存在。发现重组 GrpE 蛋白在 20 mM 盐浓度、pH 6.0 缓冲液中有较高热稳定性。获得衍射能力为 5 ?的蛋白质晶体。 结论 利用蛋白质表达纯化的经典技术，获得了高表达、高纯度的 GrpE 蛋白。为下一步蛋白质晶体的优化及相关基础研究奠定了基础。 关键词: 肺炎链球菌，热休克蛋白 GrpE ，蛋白质表达纯化，热 稳定性 2 EXPRESSION ， PURIFICATION OF THE HEAT SHOCK PROTEIN GRPE FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIA AND RESEARCH OF ITS THERMAL STABILIT ABSTRACT Objective The heat shock protein GrpE is a component of the HSP70, Which is contact with a negative regulator of heat shock gene expression. To uncover the infectious mechanism, we expressed and purified the heat shock protein GrpE from Streptococcus pneumonia. Methods Being amplified by PCR, the open reading frame of GrpE was subcloned into pW28 and expressed in E coli B834. The bacterial protein was purified by nickel chromatography column, anion-exchange chromatography column (DEAE) and gel filtration column (Superdex 75). Thermal stability was characterized with TSA m