刚地弓形虫磷酸甘油变位酶2基因的生物信息学分析、克隆表达及免疫保护性分析-病原生物学专业论文.docx

山西 山西医科大学硕士学位论文 - - PAGE 3 - 中文摘要 刚地弓形虫 PGAM2 基因的生物信息学分析、克隆、表达 及免疫保护性研究 摘 要 实验目的 对刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶 2（TgPGAM2）基因进行生物信息学分析，并对该基 因进行克隆、表达，表达产物纯化后分析其免疫原性；观察重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶 2 蛋白（rTgPGAM2）免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染的能力，探 讨 TgPGAM2 作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。 实验方法 第一部分：综述脊椎动物、无脊椎动物、原生动物等不同来源 PGAM 蛋白的理化性质 及研究进展。 第二部分：对 TgPGAM2 基因的主要特性及抗原表位进行生物信息学分析。利用蛋白 分析专家系统（ExPASy）提供的 ProtParam、SOSUI、TMHMM、HNN、MotifScan，NCBI 上的 ORF finder、Bcepred 等生物信息学在线分析程序，结合 Gene Runner、DNAman 等生 物信息学软件，分析、预测 TgPGAM2 蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性﹑可塑性， 跨膜区，翻译后修饰位点、亲（疏）水性、二级结构、抗原表位等。 第三部分：构建重组质粒 pET30a/TgPGAM2，并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。 对原核表达的 rTgPGAM2 进行纯化及免疫原性分析。收集、纯化 RH 株弓形虫速殖子，提 取总 RNA；设计合成引物并引入 Kpn I 和 BamH I 酶切位点，RT-PCR 扩增编码 TgPGAM2 的基因片段克隆到原核表达质粒 pET30a 中，阳性克隆经双酶切、PCR 及测序鉴定阳性克 隆；在大肠杆菌 BL21(DE3)中用 IPTG 诱导表达，表达产物经 SDS进行鉴定。大量 表达 rTgPGAM2，以 Ni-NTA 层析法纯化蛋白，用兔抗弓形虫血清做 Western blotting 分析 其免疫原性。 第四部分：观察不同剂量 rTgPGAM2 滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答及抗弓 形虫感染作用。BALB/c 小鼠 60 只随机分为 5 组，免疫组分别用 10μg、20μg、30μg、40μg rTgPGAM2/只滴鼻免疫小鼠，免疫 2 次，间隔 2 周，rTgPGAM2 溶于 20μl PBS 中，对照 组用等量 PBS 滴鼻。末次免疫后第 14d，随机取每组 5 只小鼠，颈椎脱臼处死，检测肠液 sIgA 和血清 IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ，分离并计数肠上皮内淋巴细胞（intestinal intraepithelial lymphocytes，IEL）及脾淋巴细胞。其余 35 只小鼠每只用 1×104 个速殖子灌胃，观察小鼠 健康情况。攻击后第 30d，颈椎脱臼处死小鼠，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。 O Objective The purpose of this study was to perform bioinformatics analysis to the phosphoglycerate mutase 2 (PGAM2) gene of Toxoplasma gondii. This gene was cloned, expressed and purified. - 4 - 实验结果 通过生物信息学分析发现，刚地弓形虫 PGAM2 有 10 个表面可及性参数≥1.9 的区域、 3 个亲水性参数得分≥1.9 的区域、3 个柔韧性参数得分≥2 的区域、8 个翻译后修饰位点、 16 个潜在抗原表位，可能具有免疫原性。 以 RH 株弓形虫速殖子的 cDNA 为摸板，扩增获得 756bp 的 TgPGAM2 基因片段，并 成功构建重组质粒 pET30a/TgPGAM2；IPTG 诱导后行 SDS分析，结果表明目的基 因在大肠杆菌 BL21（DE3）中高效表达，相对分子量（Mr）约 30ku。Western blotting 显 示，纯化后的 rTgPGAM2 能被兔抗弓形虫免疫血清识别。 30μg 组血清 IgG（A495=0.9704）、IFN-γ（A405=0.8456），肠液 IgA（A495=0.9098）高于 20μg 组（血清 IgG、IFN-γ，肠液 IgA A495 分别为 0.8213、0.7244、0.6504），组间差别有统 计学意义（F=8.741, F=4.53, F=6.94，P0.05）。血清 IL-2 和 IL-4 组间差别无统计学意义。 攻虫后第 7～14d，各组小鼠均出现倦怠、活动减少、饮水及采食减少等表现，对照组小鼠 死亡 2 只；40μg 组 1 只。30μg 组肝（58.3 ×105/g）、脑（3.99×105/g）组织内速殖子