肝靶向免疫基因载体的研究-药物分析专业论文.docxVIP

唰唰nom川川nM 唰唰no m川川nMM 州川川 民JW 唰州州Aa『 川机。 d 川川川00 . 州咄咄咄A1 恻Y 原创性声明 本人郑重声明:所里交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者:材 H期: ，lho 年句月 10 日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅:本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部成部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者: H期: lo 々月 10 R 摘要 本研究开发了一种新型的非病潜基因传递系统。通过利用多聚阳离子 PEI 压缩质粒 DNA ，然启用PEG 化的脂质体包裹 PEIIpDNA 压缩体，形成脂质复合 载体 LPD ，并将人膜岛索受体的单克降抗体(8314-SA) 与脂质中的 DSPE平EG2000-biotin 中的生物素基因 (biotin) 共辄，形成以单克隆抗体 (MAb) 为靶向基圆的复合载体 (8314-LPD) ，MAb 提高了复合载体的靶向能力。 8314-LPD 是一种肝主动靶向四元长循环基因载体制剂。其具体研究内容及结果 如下: 首先用转化的大肠杆菌扩增含有报告基囚的质粒 DNA (PEGFP-Cl) ，再用 QIAGEN 无内毒素大提试剂愈提取质粒 DNA ，并对其浓度和质量进行评定。然 后分别制备出 PEG 化的脂质体(脂质处方为 POPC 94% ，DDAB 2% ， DSPE-PEG2000 3%和 DSPE-PEG2000-biotin 1%)和 PEIIpDNA 聚阳离子压缩体， 用所得脂质体包裹 PEIIpDNA 压缩体形成了 LPD 复合物。单因素实验结合均匀 设计实验优化 LPD 处方，单因素实验嗜察结果为:质粒浓度在 40μglml 以下， 粒径变化不大，浓度增大，复合物粒径增大; NIP 超过1.5 时，质粒的包封完 全，随着 N厚的增大，复合物粒径减小，也位增大，在 NIP 等于 15 时，粒径最 小，再增大 NIP ，粒径基本不再发生变化;脂质 IpDNA 的摩尔比在 50: 1 时， 酶切电泳显示脂质可以完全包封 PEIIpDNA 压缩体，随着脂质IpDNA 的比例增 大， LPD 的粒径减小，电位降低，在 170: 1 时粒径最小，脂质IpDNA 的摩尔 比再增大，复合物粒径开始变大。均匀设计实验优化 LPD 复合物处方的结果为: 在 pH7.0 的 HEPES 缓冲液中，质粒浓度为 40μglml ，N/P 15，脂质IpDNA=170: 1 时，制备的 LPD 平均粒径为 130nm，平均刷a 电位为1.5mVo 进一步对 LPD 进行结构修饰，在外层脂质膜的 PEG 链上偶联抗人膜岛索受体的单克隆抗体 (8314-SA) ，形成肝主动靶向的单克隆抗体修饰的LipolPEIIpDNA 复合物 C8314-LPD) 。透射电镜下观察，肝靶向8314-LPD 复合物的近似球形，形态规 整，无粘迹:对其粒径电位分析，平均粒径在 150nm 左右，电位在 4.5mv 左右。 以绿色荧光蛋白基因 PEGF礼。作为报告基因考察复合物对质粒的附切保护能 力，凝胶电泳分析实验证明这种基因载体能有效地保护质粒 DNA 免受 DNA 酶 (DNase 1 )降解:血清稳定性实验表明 8314-LPD 复合物可以在血清中稳定存 在;长期稳定性实验考察结果， 4.C 和 2SC 氯气密封贮存，复合物粒径都有所增 大， {日变化幅度不间，说明温度对复合物的稳定性有明显的作用， 2S.C 贮存会 使复合物粒径在一个月内发生非常大的增大。 体外的细胞转染实验和细胞毒性实验分析， LPD 载体的转染效率小于 PEIIpDNA 压缩体，但是经单克隆抗体修饰后， 8314-LPD 基因载体能够很好的 被人肝癌细胞 SMMC7721 摄取，与前两组基因载体相比，转染率有明显的提高。 Mπ 实验中显示 LPD 和 8314-LPD 复合物的毒性都明显小于 PEI