镉恶性转化16HBE细胞中LncRNA的表达谱筛选及其对DNA修复基因的调控作用-劳动卫生与环境卫生学专业论文.docxVIP

镉恶性 镉恶性转化 16HBE 细胞中 LncRNA 的表达谱筛选及其对 DNA 修复基因的调控作用 广州医 广州医科大学硕士论文 PAGE PAGE 13 PAGE PAGE 10 镉恶性转化 16HBE 细胞中 LncRNA 的表达 谱筛选及其对 DNA 修复基因的调控作用 专 业：劳动卫生与环境卫生学 硕士学位申请人: 刘海柏 导 师：雷毅雄 教授 周志衡 副教授 中文摘要 1.背景 镉（Cadmium，Cd）及其化合物作为一类工业毒物和环境污染物，随着工业 生产的迅速发展，它对环境污染日益严重，并在职业和环境中长期存在。镉及其 相关化合物可通过工业生产或污染水源和食物进入机体造成呼吸系统、肾和骨骼 等损伤, 甚至导致肿瘤。而且，镉已被国际癌症研究机构( IARC) 列为第一类致 癌物，但镉的分子致癌机制到目前仍不清楚。研究表明，镉的致癌机制十分复杂， 不仅涉及到遗传机制，还涉及到表观遗传机制。然而 lncRNA 在镉致癌的过程中 起到什么角色的作用目前还不知道。 Long non-coding RNA(LncRNA)是一类转录本长度超过 200 nt 的 RNA 分子。 随着 lncRNA 不 断 被 发 现 ，LncRNA 不再 被 认 为 是 基 因 组 转 录 的 “ 噪音 ” ， lncRNA 在 各 种 生 物 学 过 程 、 疾 病 以 及 许 多 癌 细 胞 中 表 达 水 平 会 发 生 明 显 改 变 。 这 提 示 有些 lncRNA 很 可 能 作 为 肿 瘤 特 异 性 标 志 物 ， 随 着 对 其 功 能 的 研 究 ， 为 寻 找 治 疗 肿 瘤 的 新 方 法 提 供 了 一 种 新 的 思 路 。 然而 lncRNA 的研究还仅仅只是处于起步阶段，其功能与调控机制尚不明 确 。近年来，对 miRNA 的研究取得了很大的成果，特别是 miRNA 在金属毒物 的毒作用中作为生物标志物的探索得到了初步的证实。然而，目前对 lncRNA 研 究比较少，对 lncRNA 及其功能的研究仅仅是冰山一角，对 lncRNA 在环境毒物 中的研究更是鲜有报道。随着科学家对 lncRNA 的深入研究，将有更多的 lncRNA 被发现并证实与更多的疾病有关系。但目前对 lncRNA 通过什么机制影响疾病， 其具体功能和调控机制是如何善不清楚。 2.目的 2.1 探索镉恶性转化 16HBE 细胞中 lncRNA 和信使 RNA（Message RNA, mRNA） 的差异表达谱。 2.2 筛选出差异显著的 lncRNA 及其基因座附近协同变化的基因，从而探索 lncRNA 在镉致癌作用过程中的潜在作用。 2.3 探索镉恶性转化 16HBE 细胞中 lncRNA 对 DNA 修复基因的调控作用。 3.方法 3.1 mRNA与lncRNA芯片检测 提取细胞总RNA,进行RNA质量检测、cDNA样本合成和标记、使用Nanodrop 检测荧光标记效率、在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。使用 相关的芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果换成数字型数据保存，使 用配套软件对原始数据进行分析运算。对芯片产生的数据进行处理和均一化后， 利用统计方法筛选出差异表达的LncRNA，以参数选择P＜0.05，fold change≥2, 为筛选有差异表达。 3.2 生物信息学分析 ①差异 LncRNA 重注 释（对差 异 LncRNA 在基因组 上进行 重定 位，确 定其在染色体上的位置和其他基因的关系 ）、②差异 LncRNA 靶基因预测 (包括 cis 靶基 因预 测、trans 靶 基因预 测和 LncRNA 在 蛋白 水平的靶 基因 预测)、 ③靶基因 gene ontology 分 析（ 将靶基因向 gene ontology 数据 库各节点 映射， 计算 每个节点 的基因 数目 ）、④靶 基因 pathway 分析（向 KEGG pathway 数据 库映射， 并统计 基因 在每个 pathway 中的 富集程度 ）、 ⑤绘制 LncRNA 与 靶 基因调控 网络图 、⑥ 转录因子 结合位 点预 测（对于 差 异表达 LncRNA，提取 转录位点 上游 2500bp、下游 500bp 的序 列。使用 paster 等预测程 序对其 转录 因子结合 位点进 行预 测、⑦差异 LncRNA 与 mRNA 芯片 关联分析 ,根据 调节 方向进一 步筛选 靶基 因和分析 LncRNA 的 功能。 荧光定量PCR检测 从差异表 达LncRNA谱 中选择差 异最明 显的 20种高表 达LncRNA为 验证 对象。选取正 常16HBE细胞，镉处理 16HBE细胞5代 龄（未 恶性 转化），镉处 理1